Embriyoloji laboratuvarında yumurta toplama işlemi, mikroenjeksiyon ve tüp bebek yöntemleri, döllenme (fertilizasyon), embriyo gelişimi, AHA işlemi ve defragmantasyon ve embriyo transferi işlemleri yapılmaktadır.
Yumurta Toplama İşlemi
Yumurta Toplama İşlemi Nasıl Yapılır?
Yumurtalıklardaki olgun olmayan yumurtalar, hormonlar ile uyarılarak istenilen büyüklüğe geldiğinde, kalçadan uygulanan yumurta çatlatma iğnesi (yumurtaların olgunlaşmasının tamamlaması için OPU işleminden önce mutlaka yapılması gereken bir iğne) yapıldıktan 35-36 saat sonra doktor tarafından ultrasonografi probuna ilave edilmiş bir OPU iğnesi eşliğinde yumurtalar steril bir tüp içerisine aspire (çekilerek) edilir ve embriyoloji laboratuarına gönderilir. Embriyoloji laboratuarında bir embriyolog tarafından, steril tüp içerisinde gelen yumurtalar, mikroskop altında, folikül (yumurta kesesi) sıvısı içinden steril tek kullanımlık cam pipet yardımıyla alınır. Gelişimini devam ettirebileceği başka bir kültür sıvısı içerisine konulur. İşlem yumurta sayısına bağlı olarak yaklaşık 15-20 dakika sürer.
 |
Yumurta Toplamı İşleminden Önce Nelere Dikkat Edilmesi Gerekir?
Yumurta çatlatma iğnesinin, mutlaka doğru zamanda ve doğru şekilde yapılması çok önemlidir. Çatlatma iğnesinin yanlış yapılması durumunda, yumurtalar gelişimlerini tamamlayamazlar. Sonuç olarak, mikroenjeksiyon ya da IVF(tüp bebek) için yeterli olgunlukta ve sayıda yumurta elde edilemez. OPU, hastanın isteğine bağlı olarak genel veya lokal anestezi altında yapılmaktadır. Bu durumun önceden kararlaştırılması gereklidir. OPU, kolay ve genellikle ciddi ağrıya yol açmayan bir işlemdir. İşlem anestezi altında yapılacak ise işlem gününden önceki akşam saat 24:00'den itibaren hiçbir şey yiyip içmemeniz ve sabah size bildirilen saatte, aç olarak merkezimize gelmeniz istenecektir. İstenilen saatte merkezimizde bulunmanız, yumurtaların zamanında toplanma için dikkat edilmesi gereken konulardan biridir. Yumurtalar vaktinde toplanmadığı durumda, ovulasyon (yumurtlama) gerçekleşir. Yumurtalarınız, yumurtalıklardan ayrılarak döllenme kanallarına gider. Bu kanallardan yumurtaları almak mümkün değildir. Bu nedenle yumurtalar mutlaka OPU saatinde toplanmalıdır.
Yumurta Toplama İşleminden Sonra Dikkat Edilmesi Gereken Şeyler Nelerdir?
Yumurta toplama işleminden sonra oluşabilecek olası kasık ağrısı için, günde 2-3 tablet parasetamol(ağrı kesici) almanızda sakınca yoktur. İşlem bittikten sonra bir süre sulu gıdalarla beslenmeniz sağlanıp yaklaşık iki saat sonra hastanemizden ayrılmanıza izin verilecektir. Bu süre içinde, hemşireler tarafından hastanın kontrolleri yapılır sonrasında yapılması gerekenler sözlü ve yazılı olarak bildirilir.
Yumurta toplama işleminden sonra cinsel ilişkide bulunulmamalıdır. İşlemden 24 saat sonra banyo yapılmasında bir sakınca yoktur. Evde İstirahat edilmeli, 24 saat içinde araba kullanılmamalıdır.
OPU'dan Sonra Aşağıdaki Belirtilerden Herhangi Birinin Olması Durumunda Doktorunuza Başvurunuz!
- 38'den yüksek ateş.
- Aşırı vajinal kanama (bir miktar kanama olması normaldir).
- Çok şiddetli ve devam eden ağrı (bir miktar ağrı olması normaldir).
- Ani kilo artışı.
- İşlemden 8-10 saat sonrasında, artan ağrı ile birlikte, idrar miktarında azalma, idrarın koyulaşması veya idrar yapamama.
- Bulantı, kusma, ishal, nefes almada zorluk, karında gerginlik.
Yumurta toplanması genellikle vajina içinden ultrasonografi
ile yönlendirilen bir iğne aracılığı ile yönlendirilir.
Embriyo transferinde, embriyolar özel bir
karakter yardımı ile ultrasonografi eşliğinde
rahim içine yerleştirilir.
Mikroenjeksiyon Öncesi Yumurtaların Hazırlanması (Denüdasyon İşlemi)
Foliküllerden(yumurta kesesi) aspire edilen yumurtalar, etrafındaki hücre kümesi ile birlikte alınır. Bu hücre kümesi, yumurtaların olgunluğunu tamamlayabilmesini sağlar. Yaklaşık 1-2 saat bu hücreler yumurtanın etrafından uzaklaştırılmaz. Yumurtanın son olgunlaşma aşamasını tamamlaması beklenir. Bekleme süresinin sonunda, hyaluranidaz adı verilen enzim ve steril cam pipetler yardımı ile yumurtanın çevresindeki hücreler enzimatik ve mekanik yöntem ile yumurtadan uzaklaştırılır. Böylece yumurtalar matürasyon (olgunluk) açısından değerlendirilebilecek duruma gelir. Denüdasyon işleminden yaklaşık 30-60 dakika sonra olgunluğunu tamamlamış yumurtalara mikroenjeksiyon işlemi uygulanır.
IVF(tüp bebek) (sperm ile yumurtanın aynı kültür sıvısı içine konularak, spermin yumurtayı kendi kendine döllemesi işlemi) uygulanan yumurtalara denüdasyon işlemi mekanik yöntemle yumurtaların toplanmasından 22-24 saat sonra uygulanır.
 |
 |
|
| Olgun olmayan (Profaz I) | Olgun olmayan (Metafaz I) | |
|
|
||
 |
||
| Olgun oosit (Metafaz II) | ||
MİKROENJEKSİYON (İNTRASİTOPLAZMİK SPERM ENJEKSİYONU)
Mikroenjeksiyon, şiddetli erkek kısırlığı tedavisi için geliştirilmiş bir yardımcı üreme tekniği yöntemidir. Spermin normal dölleme özelliğine sahip olma
ması durumunda spermin yumurta içine direkt olarak enjekte edilerek döllenme amaçlanır. Şiddetli erkek kısırlığına yol açan durumlarda tüp bebek yöntemi de dahil olmak üzere bilinen diğer tedavi yöntemleri ile döllenme olmamakta veya çok düşük oranda gerçekleşmektedir. Sayı, hareketlilik ve şekil bozukluğu olan spermlerin kendiliğinden yumurtaları döllemesi mümkün olmamaktadır. Mikroenjeksiyon uygulaması, mikro-pipetler yardımı ile mikroskop altında spermin, kadından elde edilen yumurtanın içine enjekte edilmesidir. İşlemler mikroskobun ısıtılmış yüzeyinde, 200–400 kat büyütme altında ve mikromaniplatör aracılığı ile yapılmaktadır.
Mikroenjeksiyon şiddetli erkek kısırlığı dışında, IVF (tüp bebek) ile döllenme sağlanamayan veya IVF(tüp bebek) için uygun sperm ve yumurta sayı ve/veya kalitesine sahip olmayan çiftlerde uygulanmaktadır. Menideki çok az sayıda spermle işlem yapılabildiği gibi, menide spermin bulunmadığı durumlarda testislerden elde edilen spermler kullanılarak da mikroenjeksiyon yapılabilir. Bazı erkeklerde testislerde sperm bulunması mümkün olmayabilir. Bu durumda eğer varsa spermatid adı verilen ve spermin olgunlaşmamış halini oluşturan hücreler kullanılmaktadır. Spermatid kullanımı ile elde edilen sonuçlar henüz başarılı değildir. Düşük oranda döllenme ve gebelik elde edilebilmektedir. Ülkemizde ilk spermatid uygulamaları tarafımızdan başlatılmış olup “dünya tıp literatüründe” yer alan ilk spermatid ikiz gebeliği tarafımızdan elde edilmiştir. Mikro-enjeksiyon yöntemi son yıllarda kısırlık tedavisinde devrim yaratmış olup, daha önceden tedavi şansı verilmeyen birçok çift, bu yöntemle çocuk sahibi olmuştur. Prof. Dr. Semra Kahraman ve ekibi, 1994
yılında ülkemizde ilk kez mikroenjeksiyon uygulamasını gerçekleştirmiş ve bu konuda önderlik yapmışlardır. Başlangıçta menideki spermler ile mikroenjeksiyon yapılmış, ardından epididim ve testis spermleri kullanılarak ilk uygulamalar gerçekleştirilmiştir. ICSI, TESA, MESA, TESE, PESA ve mikro-TESE uygulamaları ile Türkiye'de ilk canlı doğumla sonlanan gebelikler elde edilmiştir. Mikroenjeksiyon işlemi özel donanıma sahip mikroskop altında, uçlarına açı verilmiş steril tek kullanımlık cam mikropipetler ile gerçekleştirilir.
Yumurta toplama işlemi sonucunda elde edilen yumurtalar önce çevresindeki kumulus(hücre kümesi) hücrelerinden temizlenerek, olgun olanlar ve kullanılabilecek durumdakiler belirlenir. Mikroenjeksiyon işlemi yapılacak olan steril, toksik olmayan plastik kapta, önce erkeğe ait spermlerin konulacağı özel kültür sıvısı içeren bir havuz oluşturulur. Daha sonra olgun yumurtaların konulacağı özel besi sıvısı içeren mikro damlacıklar hazırlanır. Sperm ve yumurta kendilerine ait yerlere konulduktan sonra mikroskop altında şekil olarak normal görünümlü ve varsa hareketli sperm seçilerek mikroenjeksiyon pipeti ile kuyruğun orta bölümüne bastırılarak hareketsizleştirilir. Kuyruk kısmından yakalanan sperm pipet içine alınarak yumurtanın içinde olduğu damlaya gidilir. Özel tutma pipeti ile sabitlenen yumurtanın içine hareketsizleştirilen sperm enjekte edilir(konulur). Bu işlem tüm yumurtalara aynı sıra ile uygulanır. İşlem bittikten sonra yumurtalar özel besi ortamlarına alınarak işlemden 18 – 20 saat sonra döllenme kontrolü yapılır. Normal özelliklere sahip bir meni örneğinde sperm sayısının, mililitrede en az 20 milyon, ileri hareketliliğin %40 ve normal sperm morfolojisinin (şekilsel özelliği) %4'ün üzerinde olması gereklidir. Sperm özellikleri bu değerlerin altında ise erkek kısırlığından söz edilir. Şiddetli erkek kısırlığında bu parametreler düşüktür ve spermler yumurtayı dölleme yeteneğinden yoksundur. Şiddetli erkek kısırlığı için standart bir tanım yoktur, ancak ileri hızlı hareketli ve normal morfolojideki sperm sayısının bir milyon altında olması şeklinde tanımlanabilir. Sperm ve yumurtanın tamamen normal olduğu durumlarda bile tüp bebek yöntemi ile döllenme olmayabilir. Tüp bebek yöntemi ile döllenmenin olmadığı durumlarda mikroenjeksiyon işlemine geçilmektedir. İzah edilemeyen kısırlık durumunda tüp bebek uygulaması ile % 15–20 oranında döllenme oluşmamaktadır. Bu çiftlerde sperm parametrelerinin normal olduğu düşünülerek, doğrudan tüp bebek uygulaması yapılır ise döllenme olmama ihtimali söz konusu olacağından yumurta sayısı yeterli olan çiftlerde (10 ve üzeri) mikroenjeksiyon ve tüp bebek uygulaması birlikte yapılmaktadır. Böylece yumurtalar iki gruba bölünerek tüp bebek uygulaması ile döllenme olup olmadığı kontrol edildiği gibi, mikroenjeksiyon ile döllenmeme durumuna karşı önlem alınır. Mikroenjeksiyon işlemi için çiftlerde bazı hazırlıkların yapılması gereklidir. Erkekte değerlendirme yapılırken 3-4 hafta ara ile en az 2 kez meni örneği alınır ve mikroenjeksiyon işlemi için aday olup olmadığı araştırılır.. Her değerlendirme için ortalama 3–5 günlük cinsel perhiz gereklidir. Erkeklerde ürolojik inceleme yapılır. İlave tetkikler, operasyon veya ilaç tedavisine gerek olup olmadığı araştırılır. Kadında ise üreme organlarının yapısı ve yumurtalıkların tedaviye vereceği cevabın araştırılması için yardımcı testler uygulanır.
Mikroenjeksiyon yönteminde normal yollarla yumurtayı dölleme yeteneğinden yoksun spermler kullanıldığı için gebelik elde edildiğinde bu durumun bebekte anormallik oluşturması sorgulanmaktadır. Günümüzde erkek kısırlığında ICSI ile böylesine umutlu bir tedavi olanağı sağlanmasına rağmen başarıyı belirleyen en önemli faktörler kadının yaşı ve elde edilen yumurtaların kalitesidir. İlerlemiş kadın yaşı ve buna bağlı artmış kromozom anomalileri nedeni ile erkek kısırlığı tedavisinde başarı halen kadına ait faktörlere bağlı olarak değişmektedir. 35 yaş ve üzeri kadınların yumurtalarındaki kromozom anomalisi oranı artmakta, bu durum verilen embriyoların implante olmasını (rahim duvarına tutunma) ya da oluşmuş ise gebeliğin düşükle sonlanması riskini artırmaktadır. Bazı kadınlarda ise yaşa bağlı olmaksızın azalmış yumurtalık kapasitesi nedeni ile, az sayıda ve kötü kalitede elde edilen yumurtalarda döllenme sorun olmakta ve kötü embriyo kalitesi elde edilmektedir. Normal gebeliklerde olduğu gibi yardımcı üreme teknikleri ile elde edilen gebeliklerde de düşük riski mevcuttur. Özellikle 40 yaş ve üzerindeki kadınlarda gebelik oranları ciddi olarak azalmaktadır. Yumurtalık fonksiyonları normal veya sınırda bozuk bulunan 40 yaş üstü kadınlarda tüp bebek işlemleri düşük başarı oranları çiftlere bildirilerek uygulanmaktadır.
Merkezimiz, günümüze kadar tüp bebek tedavileri ile ilgili edindiği bilgi birikimi ve deneyimleri nedeniyle Sağlık Bakanlığı tarafından Eğitim Merkezi olarak kabul edilmiştir. Yurtiçi ve yurtdışı katılım ile bugüne kadar 200’ün üzerinde doktor, embriyolog, biyolog, teknisyen ve hemşire eğitim almıştır. Merkezimizde ayda ortalama 150–200 çifte mikroenjeksiyon ve tüp bebek uygulaması yapılmaktadır.
 |
IMSI (Yüksek Mikroskobik Büyütmeyle Seçilmiş Sperm Mikroenjeksiyonu)
Yardımcı Üreme Teknikleri alanındaki en son gelişmelerden birisi olan IMSI (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection-Yüksek mikroskobik büyütme ile normal yapıda olduğu saptanan spermin mikroenjeksiyonu) uygulaması, gerekli teknik altyapının tamamlanmasının ardından, Mayıs 2008’den itibaren merkezimizde uygulanmaya başlanmıştır.
Mikroenjeksiyon işlemi (Klasik ICSI), 200–400 kat mikroskobik büyütme altında, hareketli spermler arasından, şekil olarak en düzgün olanların seçilmesine imkan vermektedir. Fakat bu durum spermin döllenme, embriyo gelişimi ve gebelik için çok önemli olan bozuklukların tanımlanmasına imkân vermemektedir. Androloji laboratuarında özel boyama teknikleri ile bu bozukluklar tanımlanabilmekte, fakat bu spermler boyama sonrası canlı kalamadıklarından mikroenjeksiyon için kullanılamamaktadır. IMSI işleminde kullanılan yüksek büyütmeli objektifler ve özel optik sistemler aracılığı ile mikroenjeksiyon için hazırlanan spermleri 8050 kata kadar büyütmek ve spermin başı içerisindeki bozuk yapıları ayırt ederek seçim yapmak mümkün olmaktadır.
Özellikle 2005 yılından bu yana yoğun olarak yapılan çalışmalarda; sperm başı içerisindeki genetik materyali içeren çekirdek kısmında bulunan vakuoller (sıvı dolu kesecikler), DNA yapısında hasar bulunabileceği konusunda ipucu vermektedir. Sperm DNA yapısındaki hasarlar, döllenme başarısızlığı, embriyo gelişiminin durması, kötü ve/veya yavaş embriyo gelişimi gibi problemlere sebep olabilmekte ve dolayısıyla gebelik şansını olumsuz etkilemektedir.
Şiddetli erkek faktörü olan vakalarda, tekrarlayan tüp bebek başarısızlığında ve nedeni izah edilemeyen kısırlık durumlarında, spermin rolünü anlamaya ve uygun yapıdaki spermlerin seçilmesine olanak veren IMSI sistemi; blastosist evresine ulaşabilecek iyi embriyoların gelişimine de imkan vermesi yönünden bu alandaki yeni ve önemli gelişmelerden birisidir.
 |
|
|
 |
 |
|
| Klasik ICSI de görülen sperm -400 büyütme- Baş anomalileri seçilememekte |
IMSI işleminde görülen sperm-8050 büyütme- Baş anomalileri kolaylıkla seçilebilmekte (solda normal, sağda anormal baş) |
|
|
|
||
 |
 |
|
| IMSI-8050 büyütme- Baş kısmında büyük vakouller içeren spermler |
IMSI-8050 büyütme- |
|
|
|
||
|
|
 |
|
| 8050 büyütme (Yüksek büyütmede sperm sınıflandırması) |
8050 büyütme (Anormal başlı ve vakuoller içeren spermler) |
|
IVF(TÜP BEBEK) (In Vitro Fertilizasyon)
IVF ilk olarak l978 yılında İngiltere’de uygulanmaya baslanmıstır. Bu yolla doğan ilk bebek olan Louise Brown, birçok çift için umut kaynağı olmuştur. Normal şartlarda bir kadın yumurtlama zamanında 1 veya 2 yumurta geliştirmesine karsın, IVF gibi yardımcı üreme tekniklerine ihtiyaç duyulduğu durumlarda, döllenen yumurta sayısı ve gelişen embriyo sayısının arttırılması amacı ile yumurtalıklar ilaçlarla uyarılarak yumurta sayısı arttırılır. IVF tekniği, mikroenjeksiyondan farklı olarak yumurtaların toplanmasından sonra yumurtalara denudasyon(sdfsffgf) işlemi uygulanmadan gerçekleştirilir. IVF işleminde, hastanın eşinden alınan ve uygun yıkama yöntemleriyle en iyi spermlerin elde edildiği sperm örneği ve yumurtalar aynı ortamda bir araya getirilir. Spermin, yumurtanın içine kendi kendisine girmesi amaçlanır. Hastanın yaşı, yumurta sayısı, kalitesi, endikasyonu(kısırlık nedeni), sperm kalitesi (sayı, hareket, morfoloji), daha önce IUI(aşılama) yada ART(tüp bebek) denemesinin olup olmadığı, sekonder kısırlık (daha önce gebe kalan fakat daha sonra kısır olan), PGT(aahasgdhdf) endikasyonu olup olmadığı değerlendirilir.
IVF(tüp bebek) hangi hastalara uygulanabilir?
- Her iki tüpü tıkalı ya da ameliyat ile alınmış olan hastalarda
- Polikistik Over Sendromu (yumurtlama problemi olan
- Hafif endometriosis, sperm değerleri normalin biraz altında olan hastalarda
- Daha önce çocuk sahibi olmuş ve eşinin spermlerinde problem olmayan hastalarda
- Daha önce IVF denenmiş ve başarılı sonuç alınmış hastalarda
- Açıklanamayan kısırlık durumunda tüp bebek uygulaması ile % 70-80 oranında döllenme başarısı elde edilebilir. Bu çiftlerde sperm parametrelerinin normal olduğu düşünülerek, doğrudan IVF (tüp bebek) uygulaması yapılır ise döllenme olmama ihtimali söz konusu olacağından yumurta sayısı yeterli olan çiftlerde (10 ve üzeri) mikroenjeksiyon ve IVF(tüp bebek) uygulaması birlikte yapılmaktadır. Böylece yumurtalar iki gruba bölünerek IVF(tüp bebek) uygulaması ile döllenme olup olmadığı kontrol edildiği gibi, mikroenjeksiyon ile döllenmeme durumuna karşı önlem alınır.
 |
ERKEN VE İLERİ DÖNEM EMBRİYO GELİŞİMİ
Tüp bebek tedavisinde en önemli basamak, laboratuvar şartlarında embriyo gelişiminin sağlanmasıdır. Döllenme sağlandıktan sonra, laboratuvar koşulları ve çalışan ekibin tecrübesi dahilinde embriyo gelişimi takip edilerek uygun olan günde transfer işlemi gerçekleştirilir.
Ancak transfer günleri, merkezlerin stratejilerine, çiftin elde edilen yumurta sayısına, gelişmekte olan embriyo kalitesine göre değişim göstermektedir. Memorial Hastanesi Tüp Bebek Merkezi ‘nde, döllenmeden sonra embriyo gelişiminin 2, 3, 4, 5 ve 6. günlerinde embriyo transfer işlemi yapılabilmekle birlikte uygun şartlarda blastosist gelişiminin gerçekleştiği 4., 5. ve 6. gün transfer uygulaması tercih edilmektedir.
Erken Embriyo Gelişimi
Pronuklear değerlendirme ve sınıflandırma
Döllenme kontrolü IVF veya mikroenjeksiyon işleminden 12-18 saat sonra yapılır. Döllenme, kısaca tek bir sperm çekirdeğinin oositten gelen çekirdek ile aktive olmuş oosit sitoplazması içinde birleşmesi olarak özetlenebilir. Normal fertilizasyonda 2 pronükleus ve birinci ve ikinci kutup cisimciği gözlenir.
Bu evrede değerlendirilen parametreler ;
- Pronukleusların(PN) pozisyonu ve boyutu ,
- Çekirdekçik öncül cisimciklerinin (NPB) sayısı , büyüklüğü ve dağılımı,
- Kutup cisimciklerinin yerleşimi ve stoplazmik halonunu varlığı dikkate alınarak yapılır.
Yapılan çalışmalar PN oluşumu sırasında meydana gelen hatalar yada asenkronizasyonun, embriyonun kromozal yapısı ve anoploidi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir.
|
Merkezimizde , pronücleus değerlendirmesi şu şekilde yapılmaktadır; A: Çekirdekçik öncü cisimcikleri büyük, kesişim noktasında ve sıralı B: Çekirdekçik öncü cisimcikleri küçük, kesişim noktasında ve sıralı C: Çekirdekçik öncü cisimcikleri büyük ve dağınık D: Çekirdekçik öncü cisimcikleri küçük ve dağınık E: Çekirdekçik öncü cisimcikleri büyüklü küçüklü, kesişim noktasında F: Çekirdekçik öncü cisimcikleri büyüklü, küçüklü ve dağınık G: Pronükleuslar birbirinden ayrı veya boyutları farklı J: Erken singami(erken birleşme) |
 |
|
 |
A skor pronükleus yapısı ve 2 polar cisim gözlenen normal döllenmiş yumurta |
A,B,C,D,E,F normal döllenen zigot olarak kabul edilir ve embriyo gelişiminde fark gözlenmez. G,J olarak sınıflanan zigotlarda normal döllenen zigot olarak kabul edilir fakat diğerlerinden ayrı olarak takip edilir.
Bölünme Evresi Sınıflaması
Döllenen bir yumurta yaklaşık 20 saat sonra ilk mitotik bölünmeye başlayarak 2 hücreli bir embriyo oluşturmaktadır. Bu dönemden itibaren embriyoların değerlendirmesi
- Blastomerlerin şekli ve boyutu ,
- Blastomerler arası fragmantasyon derecesi ,
- Blastomerlerdeki nukleus sayısı(mültinükleasyon)
- Sitoplazmik görünüm ve
- Erken kompaktlaşma gibi parametreler dikkate alınarak yapılır.
Bölünme hızına göre embriyonun sahip olduğu blastomer sayısı şayet günün beklenen limitleri arasında ise normal gelişen bir embriyo, eğer bu sayı düşükse yavaş gelişen bir embriyo olarak değerlendirilir. Normal bölünme hızına sahip bir embriyo 22-25. saatte 2 hücre, 2.günde (42-44 saat) 3-4 hücre, 3.günde(66-68 saatte) 6-8 hücre ve 4.günde ise birleşme işaretlerine bağlı olarak 10 ve üzerinde hücreye sahip olan embriyodur. Kalite değerlendirmesine göre ise eşit büyüklükte blastomer yapısına sahip olan, % 0-5 arasında fragmantasyon içeren ve sitoplazmasında belirgin granüler yapı gözlenmeyen embriyolar "I.kalite" olarak değerlendirilir. Bu değerlendirmeye göre kalite sıralaması şu şekilde olmaktadır;
| 1. Kalite | Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, %0-5 oranında fragmantasyon içeren ve granülasyon işaretleri göstermeyen embriyo. |
| 2. Kalite | Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, %5-10 oranında fragmantasyon içeren veya granülasyon işaretleri gösteren embriyo. |
| 3. kalite | Blastomerler birbirinden hafifçe farklı, %10 üzerinde fragmantasyona sahip veya granülasyon işaretleri gösteren embriyo. |
| 4. Kalite | Blastomer sayısı net sayılamayan, %30 dan fazla fragmantasyona sahip, blastomerler birbirinden belirgin derecede farklı veya ileri derecede granülasyon gösteren embriyo. |
Embriyo kalitesinin düşüşüyle birlikte embriyonun ileri gelişim gösterme, canlılığını devam ettirme ve implantasyon potansiyelide azalmaktadır.
 |
 |
 |
||
| 44. saat 4 hücreli embriyo |
72. saat 8 hücreli ve birleşme yok |
72. saat 8 hücreli ve birleşme başlamış |
İleri Dönem Embriyo Gelişimi
Fertilizasyondan sonraki 4. günde gelişen embriyodaki hücre sayısı inseminasyonu takiben yaklaşık 96 saat sonra 16–20 hücre arasındadır. Kompaktlaşma hücrelerin daha yakın bir şekilde yapışmasına neden olan bir seri hücreler arası sıkı bağlantıların (dezmozom, gap junction) oluşması sonucu meydana gelir. Embriyo kompaktlaşmaya başladığı zaman morula adını alır. Moruladan sonra kavitasyon dönemi başlar. Kavitasyonun oluşması ile kaviteden salgılanan sıvı, blastosöl oluşumunu tetikler. Kavitasyon ilerledikçe kompaktlaşma sırasında hücrelerin (blastomerlerin) kutuplaşmasıyla iki farklı hüre grubunu (trofoektoderm-dış hücre kütlesi ve inner cell mass-iç hücre kütlesi) oluşturacaktır.
4.gün embriyolarının kalite değerlendirmesi şu şekilde yapılmaktadır;
| 1. Kalite | Early blastosist,kavitasyon ve full morula ve herhangi bir anomali (fragmantasyon, vakuolizasyon gibi) içermeyen |
| 2. Kalite | Morula veya compact embriyo morfolojisine sahip en az bir anomalinin eşlik ettiği embriyo |
| 3. kalite | Morula veya compact embriyo morfolojisine sahip 2 veya 3 anomalinin eşlik ettiği veya 10 hücre ve üzeri blastomer sayısına sahip birleşmeye başlamış embriyo |
| 4. Kalite | Blastomer sayısı 10 veya daha az sayıda olan herhangi bir birleşme bulgusu gözlenmeyen embriyo |
 |
 |
 |
||
| 4. gün 10 hücreli birleşme başlangıcı gözlenen 3. kalite embriyolar |
96. saat 4.gün morula aşamasındaki 2. kalite embriyo | 96. saat 4. günde kavitasyon izlenen 1. kalite embriyo |
Blastosist oluşumu inseminasyondan sonra 5. ve 6. günlerde gerçekleşir.
Embriyoları blastosist dönemine kadar takip etmenin önemli avantajlarından birisi de yavaş gelişen veya gelişimi duraksamış embriyoların ayırt edilebilmesidir.
Blastosist gelişiminin gözlenmesi ve blastosist transferinin yapılması, embriyonun rahim içine tutunmasını ve dolayısı ile asıl hedef olan gebelik şansının artmasını sağlar. Merkezimizde blastosist aşamasındaki embriyo transferi ile sağlanan gebelik oranları %65–70 dolaylarındadır.
Bilindiği gibi son yıllarda tüp bebek tekniklerinin kullanımına bağlı olarak çoğul gebelikler daha sık görülmektedir. Bunun en önemli nedeni fazla sayıda embriyonun rahme transfer edilmesidir. Blastosist transferi ile daha yüksek oranda gebelik elde etmek amaçlandığı gibi düşük sayıda ve en iyi kalitede seçilmiş olan 1 veya 2 embriyonun transferi ile çoğul gebeliklerin neden olabileceği riskler azaltılmaktadır. Merkezimizde bir veya iki blastosist transferi yapılan vakalarda üçüz gebelik görülme oranı %1’in altındadır
Merkezimiz bu stratejiyi başarı ile beş yıldır sürdürmekte olup, çoğul gebelik oranlarında dramatik azalmalar sağlanmakla birlikte yüksek gebelik oranları elde edilmektedir. Aynı zamanda, embriyo transferi sonrası, blastosist seviyesindeki embriyolar vitrifikasyon yöntemi ile başarılı bir şekilde dondurularak saklanmaktadır.
Blastosist Dönemi Sınıflandırması Nasıldır?
Blastosist aşamasında farklılaşmış iki hücre grubundan oluşan embriyo kalitesi hakkında net bilgiler mevcuttur. Bu iki farklı hücre grubundan en önemlisi iç hücre kitlesi (embriyoblast) olarak tanımlanan ve gebelik esnasında embriyoyu oluşturmakla görevli olan hücre kitlesidir. Diğeri ise dış hücre kitlesi (trofoblast) olarak tanımlanan ve gebelik esnasında gebelik kesesi ve bebeğin beslenmesi için gerekli kısımları oluşturan hücre kitlesidir.
Blastosist skorlama sisteminde her bir embriyoya aşağıdaki kriterlere göre 3 ayrı skor verilir,
- Blastosist gelişim seviyesi (kavitasyonun başlangıcından tomurcuklanmaya kadar)
- İç hücre kütlesi kalitesi
- Dış hücre kütlesi kalitesi
| Skor | Blastosist gelişim seviyesi |
| 1 | Kavitasyonun başlaması, blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından az olması |
| 2 | Blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından fazla olması |
| 3 | Blastosöl hacminin embriyo hacminin tamamını kaplaması |
| 4 | Blastosöl hacminin embriyo hacminden büyük olması, dış çeperin incelmesi |
| 5 | Dış çeperin kırılarak tomurcuklanmanın başlaması |
| 6 | Embriyonun dış çeperden tamamen ayrılması, tomurcuklanmanın tamamlanması |
| Skor | Dış hücre kitlesi kalitesi |
| A | Birbirine sıkıca bağlı birçok hücreden oluşan epitel yapı |
| B | Daha gevşek bağlı birkaç hücreden oluşan epitel yapı |
| C | Çok az ve büyük hücrelerden oluşan epitel yapı |
| Skor | İç hücre kitlesi kalitesi |
| A | Sıkı paket halinde çok hücre içermesi |
| B | Gevşek ama birçok hücre içermesi |
| C | Çok az sayıda hücre içermesi |
 |
|
 |
||
| 5. gün 4AA kalite embriyo | 5. gün 5AA kalite embriyo |
EMBRİYO TRANSFERİ
Başarılı Sonuç İçin Başarılı Embriyo Transferi Şart
Tüp bebek tedavisinin son basamağı olan embriyo transferi önemli bir işlemdir. Ortalama olarak bir aya yakın süren tedavi sonucu geliştirilen embriyolar artık hastaya bu işlem ile transfer edilecektir. Embriyo transferinde temel prensip, embriyoların rahim içinde belirlenecek bölgeye mümkün olduğunca en az travma ile yerleştirilmeleridir. Uygun şartlarda yapılan embriyo transferi, tüp bebek tedavisinde başarıyı arttıran bir faktördür ve önemi göz ardı edilemez. Bu nedenle transferi gerçekleştirecek doktorun ve embriyoloğun dikkati, özeni ve sabrı büyük önem taşımaktadır. Kullanılan kateter tipi ve transfer yapma tekniği de başarıda etkili diğer unsurlardır.
Transfer Edilecek Embriyo Sayısı Nasıl Belirlenmektedir?
Transfer edilecek embriyo sayısı belirlenirken hem yüksek gebelik oranlarının elde edilmesi hedeflenmekte, hem de çoğul gebelik riskinin mümkün olabilecek en az düzeyde olması amaçlanmaktadır. Embriyo seçim kriterlerinin yetersizliği nedeniyle tüp bebek tedavisinin yapılmaya başlandığı ilk yıllarda çok sayıda embriyo transfer ediliyordu. Ancak zamanla yüksek teknolojik donanıma sahip merkezlerde, deneyimli ekiplerce seçilen protokol ve ilaçların en uygun dozlarda kullanımı, embriyoların doğal ortama yakın şartlardaki kültür ortamlarında geliştirilmeleri ve embriyoların seçim kriterlerinin daha iyi belirlenmesi ve özellikle blastosist dönemindeki embriyoların transferi rahime tutunma oranlarını arttırmıştır. Transfer edilecek embriyo sayısı kadın yaşı ve daha önce uygulanan başarısız tüp bebek denemeleri göz önüne alınarak, gelişen embriyoların kalitesi ve dönemine göre seçilmektedir. Merkezimizde transfer işlemi yapılmadan önce aileler ile görüşülerek bilgilendirme yapılmakta ve çoğul gebeliğin oluşturacağı riskler anlatılarak mümkün olduğunca iyi ve az sayıda embriyonun transferinin yapılması önerilmektedir. Merkezimizde uyguladığımız embriyo transfer stratejisi, sayı yeterli ise morula (4. gün) veya blastosist (5. gün) düzeyine ulaşmış 2 embriyonun rahim içine verilmesidir. Böylece üçüz ve üstü gebelikler dramatik olarak azaltılmaktadır. Ayrıca kadın yaşı çok genç ise ve tüp bebek uygulaması ilk kez yapılıyorsa, iyi kalitede blastosist varlığında tek embriyo transferi planlanabilir. İleri kadın yaşı ve tekrarlayan başarısız denemeleri olan çiftlerde ve dondurulmuş çözülmüş embriyo taransferi yapılan çiftlerde, transfer öncesi embriyonun dış çeperi olan zona pellucida'nın laser ile inceltilmesi veya tam açıklık yapılması işlemi uygulanır. Bu işlem AHA(Assisted HAtching-yardımcı yuvalama) olarak adlandırılmakta ve embriyonun zona'dan ayrılmasını kolaylaştırarak implantasyon şansını olumlu etkilemektedir.
 |
| Blastosist dönemindeki embriyolar |
İlk Muayenede Kateter Provası Yapılıyor
Embriyo transferinin kolay yapılması amacıyla hastanın ilk muayeneye geldiği gün kateter ile transfer provası yapılmakta ve böylece muhtemel zor transferler için önlem alınmaktadır. Geçirilmiş cerrahi veya elektrokoter uygulamalarına bağlı olarak rahim ağzında daralma veya yer değiştirme oluşmuş olabilir. Bunun yanı sıra miyom basısı veya doğumsal anomali gibi nedenlerle de embiyo transferi zor olabilir. histeroskopik olarak incelenmesi ve problem saptanırsa düzeltilmesi sağlanmaktadır.
 |
| Transfer katateri |
Embriyolar Ultrason Rehberliğinde ve Dolu Mesane İle Transfer Ediliyor
Embriyoların rahim içinde verileceği en uygun yerin tespit edilmesi ve rahim içi zarına dokunulmaması açısından, embriyo transfer işleminin dolu mesane (idrar torbası) ile ve ultrasonografi eşliğinde yapılması tercih edilmektedir. Bu şekilde rahim ağzı ve rahim arasındaki açı tespit edilerek, transfer kateterinin izleyeceği yol belirlenmekte ve işlemin daha az travmatik olması sağlanmaktadır. Yüksek çözünürlüğü olan ultrason kullanımı da transfer işleminin daha iyi görülmesini sağlayarak başarıyı olumlu etkilemektedir. Mesanenin dolu olması transfer işlemini kolaylaştırmaktadır. Rahimin öne doğru bir eğimi varsa rahim ve rahim ağzı arasındaki açıyı azaltmakta ve böylece rahimi düzleştirerek transfer kateterinin geçişini kolaylaştırmaktadır.
 |
 |
|
| Embriyo transfer işleminin Ultrasonografik(USG) görüntüsü | ||
Embriyo Transfer İşlemi Ağrısızdır ve Anestezi Gerektirmez
Transfer işlemi sırasında rahim ağzında bulunan mukus steril bir çubuk ile temizlenir, ince ve yumuşak bir kateter yardımı ile embriyolar rahim içerisine bırakılır. Transferde yumuşak kateter tercih edilmesi, rahim ağzında kanama riskini de azaltmaktadır Kullandığımız kateterlerin uçları ultrason ile gözlenebildiği için embriyoların rahim içinde bırakılacağı bölge net olarak tespit edilebilmektedir. Embriyolog tarafından,doktor ile eş zamanlı olarak uygun koşullarda katater içerisine yüklenen embriyoların transferi nazik bir şekilde yapıldıktan sonra kateter yavaşça çıkarılır ve embriyolog tarafından mikroskop altında bakılarak embriyoların tümünün transfer edildiği kontrol edilir.
Transfer Sonrası Uzun Süreli Yatak İstirahatı Gebelik Şansını Artırmaz
Embriyolar rahime yerleştirildikten sonra yarım saatlik dinlenme yeterlidir. Daha uzun süreli yatak istirahatının gebelik şansını arttırıcı etkisi olmadığı saptanmıştır. Hastalarımıza ilk 24 saatte fiziksel aktiviteden kaçınmalarını öneriyoruz. Daha sonraki gün ise normal yaşama dönülmesi mümkündür, hasta çalışıyorsa işine devam edebilir. Embriyo transferi sonrası 12. günde kanda gebelik testi yaptırılır. Gebelik sonucunu alıncaya kadar spor, ağır iş, ağır yük kaldırma gibi aktivitelerden kaçınılmasını öneriyoruz. Araba ve uçak yolculuğu ise yapılabilir. Seyahat edilmesinde sakınca bulunmamaktadır.
ASSİSTED HATCHING İŞLEMİ (AHA)
Embriyonun rahime tutunması, embriyoyu çevreleyen glikoprotein yapısındaki zardan (zona pellucida) embriyonun dışarı tomurcuklanmasıyla (hatching) başlar. Tomurcuklanma embriyo gelişiminin 5. veya 6.günü blastosist aşamasına ulaştıktan sonra gerçekleşir. Embriyonun rahim içinde tutunabilmesi tamamıyla zardan çıktığında mümkün olmaktadır. Tüp Bebek için kullanılan ilaçların, embriyoyu çevreleyen zarı kalınlaştırdığı veya embriyoların içinde geliştirildiği kültür medyumlarının zarı sertleştirdiğini gösteren çalışmalar mevcuttur. Embriyoları dondururken ve çözerken kullanılan solusyonlar da, embriyoyu çevreleyen zarın sertleşmesine neden olmaktadır. Bu nedenle embriyonun rahime tutunması zorlaşmaktadır. Embriyoloji laboratuarında transfer öncesi embriyonun tomurcuklanmasını kolaylaştırmak amacıyla embriyoyu çevreleyen zarın inceltilmesi veya açılması (assisted hatching) işlemi uygulanmaktadır. Böylece kalınlaşmış veya sertleşmiş zardan(zona pellucida) embriyonun kurtulabilmesi kolaylaştırılır. Embriyoları çevreleyen zar belli bir bölgesinden inceltilir veya tam olarak açılır. Bu işlem embriyo transferi yapılacağı gün, transfer edilecek embriyolara uygulanır. Böylece embriyonun rahim duvarına tutunması kolaylaştırılır. Assisted Hatching (AHA) işleminde üç yöntem kullanılmaktadır.
- Mekanik; cam mikroiğne ile embriyonun zarında açıklık meydana getirilir.
- Kimyasal; Asit tyrode solüsyonu kullanılarak embriyoyu çevreleyen zar belli bölgesinden eritilerek inceltilir veya tam olarak açılır.
- Lazer; Lazerle embriyonun zarı inceltilir veya açıklık oluşturulur. İşlem olarak en kısa sürede gerçekleştirilen ve en pratik olan yöntemdir.
Merkezimizde Lazer assisted hatching yöntemi kullanılmaktadır. Lazer asisted hatching yönteminin diğer yöntemlere göre tercih edilmesinin nedenleri şunlardır;
- Embriyonun bulunduğu kültür ortamında, herhangi bir kimyasal kullanılmadan uygulanır.
- İşlem olarak en kısa sürede gerçekleştirilen ve en pratik olan yöntemdir.
- Lazer ile yapılan açıklık bilgisayar kontrollü ve mikrosaniye süreli olduğundan güvenlidir.
- Embriyoyu ayrıca bir başka tutucu pipet ile tutmaya gerek kalmadan uygulanmaktadır.
- Ayrıca embriyolara uygulanan genetik inceleme (PGT) için, embriyodan bir hücrenin alınması amacıyla, Lazer ile embriyonun dış zarına yapılan açıklık, bu işlemin kısa sürede ve pratik olarak yapılmasını sağlar.
Tekrarlayan tüp bebek uygulamalarında, kaliteli embriyo, tranfer edilmiş olmasına rağmen, gebeliğin elde edilememesi, çoğunlukla implantasyon başarısızlığına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Nedeni izah edilemeyen implantasyon başarısızlığı durumunda ve özellikle embriyoyu çevreleyen zarın kalın olduğu durumlarda, assisted hatching işlemi implantasyon oranını artırmaktadır. AHA işlemi 2., 3. veya 4. gün transfer edilecek olan embriyolara uygulanmaktadır. AHA işlemi, 35 yaş üzerinde, FSH değeri normalin üstünde bulunan (FSH>10mlU/ml) kadınlarda, daha önceki uygulamalarında iyi kalitede embriyoların transferine rağmen gebelik gerçekleşmeyen olgularda, embriyo zarının kalın olması durumunda (>15µm) ve dondurulmuş- çözülmüş embriyolarda dondurma solüsyonlarının embriyo zarını sertleştirmesi nedeniyle kullanılmaktadır.
 |
 |
|
| Mekanik yöntem | Asit yöntemi | |
|
|
 |
|
 |
||
| Lazer yöntemi (Merkezimizde Lazer assisted hatching yöntemi kullanılmaktadır) | ||
|
|
|
|
 |
 |
|
| Tomurcuklanma embriyo gelişiminin 5. veya 6.günü blastosist aşamasına ulaştıktan sonra gerçekleşir. Embriyo zarının (Zona pellucida) erimesiyle tomurcuklanma başlar ve embriyo tamamıyla zarından dışarı çıkar. | ||
|
||
 |
||
PGT (Preimplantasyon Genetik Tanı)
Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamasında Polar Hücre Biyopsi Yöntemi
Polar hücreler yumurta hücresinin olgunlaşması ve döllenmesi sonrasında atılan yan ürünlerdir. Embriyolardaki kromozomal sayı anomalilerinin büyük çoğunluğu yumurta hücrelerinin oluşumu sırasında gerçekleşmektedir. IVF tedavisine giren 35 yaş ve üzeri kadınlarda 1. ve 2. polar hücrelerin analizi sonrasında, incelenen yumurtaların yarısından fazlası kromozomal bozukluk taşır. Özellikle Down Sendromlu bebek dünyaya getirme sıklığı 35 yaş ve üzeri kadınlarda oldukça hızlı bir artış gösterir. Bu nedenle polar hücrelerin kromozomal olarak incelenmesi ileri yaşta az sayıda yumurtası olan anne adaylarında anneden kaynaklanan kromozomal problemlerin tanısında önemli bir yere sahiptir.
 |
Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamasında Embriyo (Blastomer) Biyopsi Yöntemi
 |
Preimplantasyon genetik tanı (PGT), embriyoların anne rahmine yerleştirilmeden önce genetik açıdan ve kromozomlar yönünden incelenmesi işlemidir. Embriyolar 8 hücreli olduktan sonra laboratuarda biyopsi ile alınan bir hücreye uygulanan genetik analiz, anneye sağlıklı embriyonun transfer edilmesine yardımcı olur. Özellikle ileri anne yaşı (38 yaş ve yukarısı) söz konusu olduğunda anneden gelen kromozomlarda bozukluklar olmakta, dolayısı ile embriyolar şekil ve yapı itibarı ile normal görünseler bile kromozom anomalilerine bağlı olarak gebelik gelişmemekte veya gelişen gebelik düşükle sonlanabilmektedir. Yapılan araştırmalarda iyi kalitede görünen embriyolarda hemen hemen % 38 – 40, kötü kalitedeki embriyolarda %90’lara varan oranlarda kromozomal bozukluk saptanmıştır. PGT’nin amacı kromozomal anormallikler açısından en az riskli olan embriyoların seçiminin sağlanmasıdır. PGT; ileri anne yaşı yanı sıra tekrarlayan düşükleri olan vakalarda, tekrarlayan başarısız tüp bebek denemesi olan çiftlerde, şiddetli erkek infertilitesi olan vakalarda, genetik hastalık riski taşıyan vakalarda uygulanmaktadır. PGT ile kromozomal anormalliklerin saptanmasının avantajları; embriyonun rahim içine tutunması ve gebelik şansının artması, düşük riskinin azalması, kromozomal açıdan normal bir bebek sahibi olma şansının artmasıdır. Diğer yandan ağır erkek kısırlığı ile başvuran çiftlerde altta yatan sebebin yüksek oranda genetik kaynaklı olduğu gözlenmektedir. Bu çiftlerde de öncelikle erkeğin spermlerinde genetik analiz yapılarak durumun saptanması ve ardından embriyolarda genetik tanı yapılarak sağlıklı embriyoların transferi gebelik şansını önemli oranda arttırmaktadır.
Yukarı
PGT uygulamasından yarar sağlayacak bir diğer hasta grubu da Talasemi ( Akdeniz Anemisi), Kistik Fibroz, Ailevi Akdeniz Ateşi ve bunun gibi kalıtsal hastalık taşıyıcı bireylerdir. Özellikle her ikisi de Talasemi taşıyıcısı olan çiftlerden hastalıklı çocuk doğma olasılığı % 25 olup bu hastalık ömür boyu tedavi gerektiren, sürekli kan nakillerine gereksinim duyulan iyi tedavi edilmediği takdirde hastaların erken yaşlarda kaybedildiği ciddi bir durumdur. Taşıyıcı olduğu bilinen çiftin gebelik öncesi genetik tanı yöntemleri ile sağlıklı çocuk dünyaya getirmesi sağlanabileceği gibi; taşıyıcı olduğunu ancak hastalıklı bir çocuğa sahip olduktan sonra öğrenen çiftlerde de yine bu yöntemle ve doku tipi uyumlu bir bebek dünyaya getirilerek bu bebeğin kordon kanından veya kemik iliğinden yapılacak nakil ile hastalıklı kardeşte tam şifa sağlanabilmektedir. Unutmamalıdır ki talasemi taşıyıcılığı yurdumuz genelinde %4,5 oranında görülürken Akdeniz ve Trakya bölgelerinde bu oran %12 civarına çıkabilmektedir.
Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamasında Trofektoderm Biyopsi Yöntemi
Tüp Bebek tedavisiyle oluşturulan embriyolar anne rahmine yerleştirilmeden önce genetik açıdan incelenebilir. Böylece sağlıklı embriyonun seçimi gerçekleştirilir.
Genetik hastalıkların tanımlanması ve HLA uyumlu embriyonun seçimi amacıyla embriyo gelişiminin 3. veya 5. günlerinde uygulanan biyopsi işlemi ile alınan hücreler genetik laboratuarında PCR yöntemi ile analiz edilirler. PCR yöntemi alınan her bir hücredeki DNA materyalinin başarılı bir şekilde çoğaltılması esasına dayanır. 3. günde 6-8 hücre (blastomer) içeren embriyodan yalnızca bir hücre alınarak PCR işlemi uygulanabilirken, 5. günde blastosist gelişimi gösteren embriyonun trofektoderm hücrelerinden 5-6 hücre alınarak PCR yöntemi ile daha güvenilir sonuçlar elde edilebilmektedir.
Laboratuarda uygun kültür ortamında 5. günde blastosist aşamasına gelen embriyolara preimplantasyon genetik tanı amacıyla biyopsi işlemi uygulanmaktadır. Blastosist aşamasındaki embriyonun trofektoderm hücrelerinden plasenta, iç hücre kitlesinden ise fetüs (bebek) gelişmektedir. Blastosist aşamasında embriyonun toplam hücre sayısı yaklaşık 40-150’dir. Blastosist biyopsisinde yalnızca trofektoderm hücrelerinden 5–6 hücre alınarak, iç hücre kitlesine dokunulmaz. Biyopsi ile alınan hücre sayısı arttığı için genetik incelemede tanı koyma başarısı yükselir.
Embriyo gelişiminin 3. gününde embriyonun dış zarında (zona pellucida) lazer ışınları gönderilerek küçük bir açıklık oluşturulur. 5. veya 6. günde açılan açıklıktan mikro düzeyde ince cam biyopsi pipetiyle 5–6 trofektoderm hücresi blastosistten biyopsi yolu ile ayrıştırılır. Alınan bu hücreler genetik hastalık yönünden sağlıklı ve/veya hasta kardeş ile doku uyumu olan embriyonun seçilmesi amacı ile genetik laboratuarına verilirken embriyo gelişimi laboratuar koşullarında devam ettirilir. 24–48 saat süren yoğun genetik testler sonuçlanır. Belirlenen uygun embriyolar anne adayının rahim içine transfer edilir.
İlk kez ekibimiz tarafından, Akdeniz anemisi hastalığına sahip bir çocuğu olan ailede tüp bebek yöntemiyle elde edilen embriyolardan, hasta çocukla aynı doku tipi ile uyumlu olan sağlıklı embriyolar, trofektoderm biyopsi yöntemi uygulanarak seçilmiş ve gebelik elde edilmiştir.
 |
|
 |
 |
|
| Biyopsi öncesi blastosist aşamasındaki embriyo | Embriyo holding pipetle tutulur | |
|
||
 |
 |
|
| 5-6 trofektoderm hücresi biyopsi pipeti ile aspire edilir. | ||
|
||
 |
 |
|
| Lazer ışınları yardımı ile trofektoderm hücreleri blastosisten ayrıştırılır | Biyopsi sonrası normal gelişmine devam eden blastosist | |
Yukarı
EMBRİYO DONDURULMASI (VİTRİFİKASYON)
Embriyo dondurma işlemi, tüp bebek tedavisi gören hastalarda, embriyo transferi sonrası kalan embriyolardan uygun kalitede olanların özel bir hazırlık işlemine tabi tutulduktan sonra sıvı azot içerisinde saklanmasıdır.
Tüp bebek denemesinde gebelik elde edilememesi, gebelik elde edilip düşükle sonlanması ya da doğumla sonlanan bir gebelikten sonra çiftin tekrar bir bebek dünyaya getirmeye karar vermesi durumunda, daha önce kendi sperm ve yumurta hücrelerinin döllenmesiyle elde edilen ve dondurulan embriyoları çözülüp kadın rahmine yerleştirilerek gebelik sağlanabilir. Bu yöntemle kadına uzun süren hormon ilaçlarının verilmesi engellendiği gibi tüp bebek işlemindeki gerekli birçok aşama atlanacağı için maliyet bakımından da çiftlere kolaylık sağlamaktadır. Merkezimizde embriyo dondurma teknikleri ile elde edilen sağlıklı gebelik oranı % 38 ile 40 oranındadır.
Embriyoların dondurulması çeşitli nedenlerden dolayı zorunlu olarak da yapılmaktadır. Embriyoların transfer edileceği dönemde kadına ait herhangi bir sorun ortaya çıkması durumunda (örneğin hormon tedavisi sırasında yumurtalıkların aşırı uyarılması, OHSS) tüm embriyolar dondurulup, kadında hayati risk oluşturan bu tablonun gerilemesinden sonra daha emniyetli bir zamanda çözülerek transfer edilebilirler. Yine rahim içi zarının (endometriyum) kalınlığının gebelik için yeterli olmaması durumunda da embriyolar dondurularak saklanıp, endometriyum gelişiminin yeterli olduğu başka bir dönemde çözülerek transfer edilebilirler.
Embriyolar 1.günden 6. güne kadar gelişimlerinin her aşamasında dondurulabilmektedir. Ancak çözme sonrası en yüksek sayıda canlı embriyo elde edilebilmesi için dondurma işleminin, embriyoların gelişim aşamasına özel bir teknikle uygulanması gerekmektedir. Embriyo transferi sonrası kalan sağlıklı embriyoların dondurulması için, Türkiye’de ilk olarak merkezimizde gerçekleştirilen, başarısı klinik deneyler ile ispatlanmış olan embriyo vitrifikasyon, bir başka ifade ile camlaştırma, yöntemi kullanılmaktadır. Vitrifikasyon yönteminin en önemli özelliği, embriyoların yüksek yoğunluktaki koruyucu madde ile 3–4 dakika muamele edildikten sonra dakikada eksi 2000–20.000 santigrad derece soğutma hızı ile hasar görmeden dondurulabilmesine imkan sağlamasıdır. Klasik-yavaş embriyo dondurma yönteminin aksine, vitrifikasyon veya hızlı dondurma yöntemi ile, özellikle 3.ve 4.gün ve blastosist dediğimiz 5.ve 6 gün embriyoları çok daha başarılı bir şekilde dondurulmaktadır. Dondurma yönteminin başarısını gösteren en önemli kriterleden biri olan çözme sonrası embriyolardaki canlılık oranı, vitrifikasyon ile dondurulup çözülmüş olan embriyolarda neredeyse %100’e yakındır. Embriyo çözme sonrası yüksek canlılık oranına ilave olarak vitrifikasyon yöntemi, anne adaylarına tekrar ve yüksek gebelik şansı veren en başarılı dondurma yöntemidir.
Merkezimizde embriyo dondurma teknikleri ile elde edilen sağlıklı gebelik oranı % 38 ile 40 oranındadır.
Teknik olarak çok daha uzun süreler saklanabilmelerine rağmen, ülkemizde embriyoların dondurularak saklanma süresi Sağlık Bakanlığı Üremeye Yardımcı Teknikler Üst Kurulunun hazırladığı yönetmelik gereğince 5 yıl olarak sınırlanmıştır. Yine bu yönetmeliğe göre embriyo dondurma ve çözme işlemi ancak eşlerin yazılı onayıyla gerçekleştirilebilmekte, çiftin boşanması, eşlerden birinin ölümü veya saklama süresinin dolması durumunda saklanan embriyolar imha edilmektedir.
 |
 |
 |
 |
|||
| Embriyo dondurma (Vitrifikasyon) | ||||||
|
|
|
||||
 |
 |
 |
 |
|||
| Embriyo çözme | ||||||
|
|
|||
 |
 |
 |
||
| Dondurulmuş embriyoların saklandığı sıvı azot tankları (-195 ºC) | ||||
Yukarı
RAHİM İÇİ DOKU KÜLTÜRÜ (Endometrial Ko-kültür)
Endometrial ko-kültür ortamları, embriyoların transfer dönemi öncesi doğala yakın bir ortamda gelişimlerine izin veren sistemlerdir. Ko-kültür sistemlerinin embriyo gelişimine olumlu etkisi, vücut içindeki şartları başarı ile taklit etmesi esasına dayanır.
Tüp bebek uygulamalarında başarı, kadına ve erkeğe ait birçok faktörün bir araya gelmesi sonucu ortaya çıkmaktadır. Bu faktörlerin büyük bölümü henüz tanımlanamamış olmakla birlikte, kadına ait genetik faktörler, rahim içi faktörler, hormon bozuklukları ve rahim anormallikleri gibi nedenlerin başarıyı olumsuz etkilediği bilinmektedir. Endometrial Ko-kültür, hazır kültür sıvılarının kullanıldığı standart tüp bebek uygulamalarında embriyo kültürü için bir alternatif olarak öne çıkmaktadır.
Ayrıca embriyonun gelişimini destekleyen birçok embriyotrofik madde salgılar,ortama büyük moleküllerin eklenmesini arttırır.İleri evreye ulaşmış blastosist dönem embriyolarında,bebeği oluşturacak olan iç hücre kütlesindeki hücre sayısını arttırır.
Endometrial Ko-Kültür Hangi Hastalara Uygulanabilmektedir?
Daha önceki tüp bebek tedavilerinde embriyoların yavaş gelişim gösteren vakalarda önerilmektedir. Üçüncü güne ulaşmış bir embriyoda 6 veya daha az hücre varsa yavaş gelişim söz konusudur. Böyle gelişim gösteren embriyolarda ko-kültür embriyonun gelişimini hızlandırmaktadır.
Daha önceki denemelerde elde edilen embriyolarında gelişim duraksaması, yani embriyonun hücre sayısını arttıramadığı gözlenen vakalarda kullanılmaktadır.
Daha önceki denemelerde kötü kalitede embriyo elde edilmesi durumunda (embriyonun içinde hücresel artıkların bulunması ve hücrelerin birbirine eşit olmaması) kullanılmaktadır.
İyi kalite embriyo transferine rağmen, gebe kalmadaki başarısızlık, tüp bebek uygulamalarında önemli bir problemdir. Tüp bebek başarısını sınırlayan en önemli faktör, tutunma başarısızlığıdır. İyi gelişim gösteren blastosist dönem embriyosunun, alıcı gücü iyi olan rahim dokusuna tutunması başarılı bir gebelik için en önemli faktördür. Tüp bebek tedavisinin başarısı embriyo ve endometriumun uyumlu gelişimine bağlıdır.
Tekrarlayan implantasyon başarısızlığında, embriyo ve endometrium bağlantılı problemler önem kazanır.
 |
||||
|
|
|||
 |
 |
 |
||
Endometrial Ko-Kültür Nasıl Yapılır?
Yumurtlama döneminden yaklaşık bir hafta sonra kadının rahim içi dokusundan ince bir kanül ile alınan ufak bir parça laboratuar koşullarında kültüre edilerek çoğaltılır. Bu kültür süreci 1 ila 3 hafta arası sürmektedir. Endometriumdan alınan hücreler, yoğunlukla embriyonun tutunabileceği sekresyon dönemi hücrelerinden oluşmaktadır. Bu hücreleri işlem sırasında kullanılmak üzere dondurmak mümkündür. Eğer bir sonraki adet döneminde tedavi planlanıyorsa kültür devam ettirilir. Daha ileri bir tarih planlanması durumunda ise gelişen hücreler dondurularak saklanır.
Rahim içi dokusunun laboratuarda kültür için hazırlanması ve sonraki kültür aşaması bilgi, tecrübe ve yoğun iş gücü gerektiren hassas işlemlerdir. Kültür sürecinde hücrelerin gelişiminin adeta embriyo gelişimi gibi takip edilmesi ve 48 saat aralıklarla bu hücreleri besleyen kültür sıvılarının tazelenmesi gerekmektedir. Dolayısıyla ko-kültür uygulamasının, bu konuda eğitimli, tecrübeli personele ve teknik altyapıya sahip bir laboratuarda gerçekleştirilmesi önemlidir.
Elde edilen ayrıştırılmış hücreler kültürde çoğalarak yaygınlaşır ve kültür kabında tek tabakalı bir yüzey oluşturur. Döllenme sonrası embriyolar bu doku üzerine yerleştirilerek geliştirilir. Ko-kültür çalışmalarında serum olarak hastanın kendi kanından elde edilen inaktive edilmiş ve filtrasyondan geçirilmiş serum tercih edilir.
Ko-kültür ortamında embriyo ve rahim içi doku arasındaki ilişki rahim içindekine benzer şekilde gelişmekte ve embriyo ile endometrium arasında etkileşim oluşarak, endometrial doku, embriyo gelişimi için gerekli büyüme faktörlerini salgılamaktadır. LIF, IGF, Gm-CSF, TGFa, ILa gibi büyüme faktörleri ve sitokinler embriyonun normal gelişimine katkıda bulunurken, parakrin moleküller (b3 integrin) embriyonun endometrial hücrelerle ilişkisini geliştirerek rahim içine tutunma (implantasyon) ihtimalini arttırırlar. Ayrıca, embriyonun metabolizması sonucu ortaya çıkan artık maddelerin bu hücreler tarafından etkisizleştirilmesi (detoksifikasyon) embriyo gelişimini olumlu yönde etkilemektedir.
 |
 |
|
| Ko-Kültürde 3. gün embriyo gelişimi | |
Ko-Kültürde 6. gün blastosist gelişimi |
Endometrial ko-kültür uygulanan hastalarımızda embriyo seçiminin daha etkili yapılabilmesi ve ko-kültür hücrelerinden en yüksek fayda sağlanabilmesi için embriyo kültürü ileri günlere kadar devam ettirilmelidir. Embriyo sayısının da yeterli olması şartıyla, endometrium ile embriyo arasındaki etkileşimin en yüksek düzeyde olduğu dönem olan embriyo gelişimi 4, 5 ya da 6. güne kadar devam ettirilmekte ve blastosist aşaması olarak tanımlanan bu dönemde transfer yapılması tercih edilmektedir. Blastosist transferinin fizyolojik olarak daha yüksek tutunma ile sonuçlanması, blastosiste ulaşan embriyoların genomlarının daha aktif ve sağlıklı olmaları ve devam eden gebeliklerin daha fazla olması nedeni ile genellikle blastosist çalışmalarında ko-kültürü tercih etmekteyiz.
Merkezimizde bugüne kadar 1000’e yakın hastamızda ko-kültür uygulanmış, daha önceki tüp bebek denemeleri başarısızlıkla sonuçlanan bu hastalarda, artan implantasyon ve gebelik oranları elde edilmiştir. Türkiye’de ilk olarak merkezimizde uygulanmaya başlanan ve dünyada da az sayıda merkezde uygulanan bu yöntemle elde edilen başarılı sonuçlar ko-kültür uygulamalarına giderek artan oranda devam etmemizi sağlamıştır.
Yukarı
Endometrial co-culture hücrelerin dondurulması
Endometrial coculture işlemleri sırasında elde edilen hücreler işlem sırasında hastaya ait embriyoların kültüründe kullanılırken (primer kültür) alternatif olarak belirli koşullarda ve özel yöntemler kullanmak suretiyle dondurularak saklanabilirler. Böylece istenildiğinde daha ileri bir tarihte gerçekleştirilecek yeni bir tedavi sırasında kullanılabilirler. Endometrial coculture hücreleri dondurma işlemi embriyoloji ve androloji laboratuarlarında gerçekleştirilen diğer işlemler gibi özel teknik ve araçlar gerektirmektedir. Bu araçlar yardımıyla hücreler bulundukları kültür ortamından ayrıştırılarak gliserol ve DMSO gibi belirli oranlarda kriyoprotektan ajanlar içeren ortamlarda ve belirlenmiş soğutma oranlarında -70°C ye kadar soğutulur ve sıvı nitrojen içerisinde saklanırlar. Yeni bir tedaviye başlanıldığında, belirlenen günde çözülerek tekrar kültür ortamına alınırlar. Böylece endometrial coculture hücreleri birden fazla tedavi işlemi sırasında kullanılabilmektedir.
OVER DOKUSU DONDURULMASI VE TRANSPLANTASYONU
Günümüzde, gelişen tedavi yöntemleri ile birçok kanser türünde kür sağlanabilmektedir. Bu sevindirici ilerlemelere rağmen bu tür tedaviler sonrasında birçok genç kadın hayatının geri kalan kısmını infertil olarak geçirmekte ve erken dönemde menopozla karşı karşıya kalmaktadır. Aynı problem çocukluk yaşı tümörleri, rahim kanseri gibi erken yaşta herhangi bir nedenle yumurtalıkları ameliyat ile alınmış kadınlar için de geçerli olmaktadır. Böyle durumlarda, yumurtalıkların veya yumurtalıklardan alınan bir parçanın, çeşitli koruyucu maddeler içerisinde dondurularak saklanması işlemi merkezimizde uygulanmaya başlanmıştır. İşlemde yumurtaları içeren yüzey dokusundan bir örnek alınır, küçük parçalar halinde dondurularak saklanır. Dondurulan dokular daha sonra çözülerek kullanılmak üzere -196o‘de sıvı azot tanklarında saklanır. Over dokusunun dondurulup çözüldükten sonra tekrar vücuda yerleştirildiğinde, fonksiyonlarını koruduğu gözlenmiştir. Bu yöntem yumurtalık kapasitesini erken yaşta kaybetme riski ile karşı karşıya kalan kadınlar için bir ümit oluşturmaktadır.
 |
| Over dokusu dondurma işlemleri |
LABORATUVAR KALİTE KONTROLÜ
Embriyoloji laboratuarı, embriyo gelişiminin rahim dışı ortamda (in vitro) gerçekleştirildiği ortam olması nedeniyle bir tüp bebek merkezinin en önemli parçasıdır ve yine bu nedenle bu laboratuar ortamındaki her türlü değişkenin titizlikle takip edilmesi tüp bebek tedavisinde başarıyı etkileyen en önemli faktördür. Bu amaçla merkezimizde SCADA 3000 IVF Laboratuvar Kalite Kontrol sistemi kullanılmaktadır.
SCADA3000 sistemi, laboratuvar oda ve cihazlarına ait toplamda 72 parametreyi elektronik sinyaller halinde sürekli ölçen, belirlenen aralıklarla bu verileri kaydeden ve tanımlı limitlerden sapma durumunda çeşitli alarmlar(sesli,çağrı,sms,e-mail) yoluyla laboratuar personelini bilgilendiren özel bir sistemdir. Sistemi oluşturan sinyal giriş üniteleri ve sinyal çeviriciler arasında özellikle kablolu iletişim seçilmiştir. Bu, embriyo gibi hassas hücrelerin elektro manyetik alanlarından etkilenmemesi için özellikle seçilmiştir. Ayrıca sistem olası bir elektrik kesintisinde çalışmaya devam edebilmesi için bir kesintisiz güç kaynağına bağlıdır. Sistemin takip ettiği parametreler şunlardır;
- İnkübatör karbondioksit,oksijen ve sıcaklık değerleri
- İnkübatör kapak açılış-kapanışları
- Laboratuar kapı açılış-kapanışları
- Laboratuar içi sıcaklık,nem ve karbondioksit
- Oda basınçları
- Buzdolabı sıcaklıkları
- Kriyotank sıvı nitrojen seviyeleri
İnkübatör karbondioksit,oksijen ve sıcaklık değerlerinin takibi, embriyo kültürünün yapıldığı inkübatörlerde embriyoların içinde bulunduğu kültür sıvısının embriyo için uygun olan asitlik derecesine ve sıcaklığının istenen koşullarda tutulduğunun kontrolü açısından önemlidir.
İnkübatör kapak açılış-kapanışlarının takibi hem inkübatör kapağının yanlışlıkla açık bırakılmasını önlemekte hem de bu verilerin inkübatörler arasındaki farklılığını görerek laboratuarda bulunan vakaların inkübatörler arasında eşit olarak dağıtılmasını sağlaması açısından önemlidir. Böylece bir inkübatöre diğerlerinden fazla vaka konularak o inkübatörün koşullarının gereksiz yere etkilenmesi engellenmiş olur.
Laboratuar kapı açılış-kapanışlarının ve oda basıncının takibi laboratuvar giriş-çıkış sıklığının ölçülebilmesi ve laboratuvar havasının sterilizasyonunun korunması için gerekli olan pozitif oda basıncının (laboratuara dışarıdan hava girişini engelleyen basınç farkı) korunmasını sağlamak bakımından önemlidir.
Laboratuar içi sıcaklık,nem ve karbondioksit değerlerinin takibi, bu değerlerin değişiminden etkilenebilecek, başta inkübatörler olmak üzere, cihazların korunması, hücrelere inkübatör dışında uygulanan işlemlerde (yumurta toplama,mikroenjeksiyon,embriyo değerlendirmesi vs.) uygun koşullarda çalışılması ve laboratuar personelinin çalışma koşullarının uygunluğunun kontrolü bakımından önemlidir.
Buzdolabı sıcaklıklarının takibi, bu cihazlar içerisinde saklanan, başta kültür sıvıları olmak üzere, laboratuar kimyasallarının uygun koşullarda saklandığının kontrolü bakımından önemlidir.
Kriyotank sıvı nitrojen seviyelerinin kontrolü, bu tanklar içerisinde saklanan ve canlılıklarının korunabilmesi için sıvı nitrojen(-190°C) içerisinde bulunması gereken embriyo, sperm ve over dokularının güvenliği bakımından önemlidir.
Sonuç olarak bu sistem sayesinde,mesai saatleri dışındaki zamanlarda dahil olmak üzere, hastalarımızın laboratuarımıza emanet etmiş olduğu hücrelerin en iyi koşullarda işlem gördüğü ve saklandığı garanti edilmiş olmaktadır.
 |
 |
||||
| Ana kontrol ünitesi | Görsel alarm ünitesi | ||||
 |
 |
 |
|||
| İnkübatör parametreleri | İnkübatör kapı sensörü | Kriyotank ölçüm baskülleri | |||
 |
 |
 |
|||
| Oda kapı ve hava basınç sensörü |
Ortam ölçüm sensörü | Havalandırma(HEPA) ölçüm sensörü |
|||