PREİMPLANTASYON GENETİK TANI

Tüp bebek yöntemi ve yardımcı üreme tekniklerinin gelişmesinden sonra, bu yöntemlerle oluşturulan embriyolarda daha gebelik elde edilmeden genetik açıdan inceleme mümkün olmuştur. Hastalığa sebep olan geni veya kromozomal bozukluğu gebelik oluşmadan önce test ederek sağlıklı embriyoların transfer edilmesi işlemine “İmplantasyon öncesi genetik tanı” veya “preimplantasyon genetik tanı (PGT)” adı verilir.

PGT yöntemi dünyada ilk defa 1989 yılında İngiltere’de tek hücre PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) tekniği kullanılarak kalıtsal bir hastalık için uygulanmış olup, ülkemizde PGT yöntemi ilk olarak 1997 yılında ileri anne yaşı ve tekrarlayan tüp bebek başarısızlığı olan çiftlerde Dr. Kahraman ve arkadaşları tarafından uygulamaya konulmuştur. 2000 yılında Amerika’da geliştirilen embriyoda genetik tanı ve HLA tipleme çalışmaları ile PGT, salt bir tanı yöntemi olmakla kalmayıp, ailelerin sağlıklı bir bebek sahibi olmasını sağlarken hasta çocukların doğan kardeşlerinden alınan HLA uyumlu kök hücreler ile tedavi olabilmesini de mümkün kılmıştır. Kahraman ve ekibi, 2003 yılında embriyolarda tekgen hastalıklarının tanısı ve HLA doku tayininin ülkemizdeki ilk uygulayıcıları olmuştur.

Embriyo Analiz Yöntemleri

PGT işlemi embriyoların 3 farklı gelişim evresinde uygulanabilir: döllenme öncesi ve sonrası dönemde polar hücre analizi, bölünme aşamasında blastomer analizi ve son olarak blastosist dönemde trofektoderm dokusu (trofoblast hücreleri) analizi (Şekil 1A,1B,1C). Bu yöntemler tek başlarına veya tanıyı doğrulamak amacıyla birlikte de kullanılabilir. Kullanılan biyopsi teknikleri ve laboratuvar çalışanlarının tecrübesi, biyopsi sonrası embriyo gelişiminde çok önemli rol oynar. Klinik, embriyoloji ve genetik laboratuvarının standartlarını yüksek tutması sonuçları etkileyen en önemli faktörlerin başında gelmektedir.

Şekil 1: Polar hücre biyopsisi (A), 8-10 hücreli bölünme aşamasında embriyoya uygulanan blastomer biyopsisi (B), blastosist aşamasında embriyoya uygulanan trofektoderm biyopsisi (C). (Görüntüler İstanbul Memorial Hastanesi, Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarında alınmıştır)

a. Polar hücre analizi

Polar hücreler yumurta hücresinin olgunlaşması ve döllenmesi sonrasında atılan yan ürünlerdir. Embriyolardaki kromozomal sayı anomalilerinin büyük çoğunluğu yumurta hücrelerinin oluşumu sırasında gerçekleşmektedir. IVF tedavisine giren 35 yaş ve üzeri kadınlarda 1. ve 2. polar hücrelerin analizi sonrasında, incelenen yumurtaların yarısından fazlası kromozomal bozukluk taşır. Özellikle Down Sendromlu bebek dünyaya getirme sıklığı 35 yaş ve üzeri kadınlarda oldukça hızlı bir artış gösterir (Şekil 2). Bu nedenle polar hücrelerin kromozomal olarak incelenmesi ileri yaşta az sayıda yumurtası olan anne adaylarında anneden kaynaklanan kromozomal problemlerin tanısında önemli bir yere sahiptir.

 

Şekil 2: Özellikle 35 yaş ve üzerinde Down sendromlu çocuk dünyaya getirme sıklığı artar. 44 yaşındaki anneler genç annelere göre ise yaklaşık 40 kat daha artmış risk taşımaktadır.

b. Blastomer analizi

Döllenmeden yaklaşık 68-72 saat sonra ve en az 6-8 hücre aşamasına gelmiş embriyolara uygulanan bu yöntem (Şekil 1B), embriyonik gelişimin 3. gününde blastomer adı verilen hücrelerden birinin alınması ile gerçekleştirilir. Blastomer biyopsisi, anne/baba geçişli otozomal çekinik/baskın tek gen hastalıklarında, HLA doku tipleme, translokasyon (yapısal kromozom anomalisi) taşıyıcılığı, ileri anne yaşı, tekrarlayan düşükler, tekrarlayan tüp bebek başarısızlıkları ve şiddetli erkek faktörü gibi geniş bir endikasyon grubuna uygulanabilmektedir.

Mini Sözlük In vitro fertilizasyon, IVF (Tüp Bebek): Kadının yumurtasının, eşinin spermleri ile laboratuvar ortamında biraraya getirilerek döllenmesini sağlayan bir yardımcı üreme yöntemidir. Polar hücre: Yumurta hücresi oluşurken meydana gelen asimetrik hücre bölünmesi sonucu atılan yan ürünler. Polar hücrenin incelenmesi, yumurtadaki genetik bilginin dolaylı yoldan analizine olanak sağlar. Yumurta hücresi olgunlaşırken ve döllendikten sonra toplam 1. ve 2. olmak üzere iki adet polar hücre oluşur. Blastomer: Embriyonun gelişiminin ilk günlerinde bölünme aşamasındayken içerdiği hücrelere verilen ad. Blastosist: Embriyonun gelişiminin 5. gününde iç ve dış hücre kitlesinin belirginleştiği evredir. Embriyoyu oluşturacak olan embriyoblast (iç), plasentayı oluşturacak olan trofoblast (dış) ve ortasında sıvı dolu bir bölümden oluşur. Bu evrede yaklaşık 70-100 hücre bulunmaktadır. Anöploidi: Sayısal kromozom bozukluğu. İnsan vücut hücrelerinde biri anneden biri babadan olmak üzere birer kromozom aktarılır. Embriyoda aynı kromozoma ait 3 adet (trizomi), veya tek (monozomi) kromozom bulunduğunda yaşamla bağdaşmayan veya erken gebelik döneminde kaybedilen anormallikler oluşur. İnsanda en sık görülen anormallikler trizomi 21 (Down Sendromu), trizomi 16, trizomi 13 (Patau Sendromu) ve Trizomi 18 (Edwards Sendromu); cinsiyet kromozomlarına ait en sık görülen anormallikler monozomi X (Turner Sendromu) ve Trizomi XXY (Klinefelter Sendromu) ‘dur. Mozaiklik: Anöploidinin incelenen bireyin hücrelerinde belirli bir oranda bulunması durumu

c. Blastosist dönemde trofektoderm doku analizi

Son yıllarda daha çok tercih edilen bu yöntem, bir defada daha çok hücrenin analizinin yapılmasını ve gebelik oranlarının arttırılmasını sağlamaktadır.
Embriyonik gelişimin 3. gününde mekanik, kimyasal veya lazer yöntemlerinden biri kullanılarak meydana getirilen açıklık sayesinde (assisted hatching), embriyonik gelişimin 5. gününde kolaylıkla biyopsi yapılması sağlanır. Trofektoderm biyopsi yöntemi diğer yöntemlere göre birçok noktada üstünlük sağlar. İncelenen hücre sayısı genetik testlerde ve özellikle moleküler analizlerde kritik öneme sahiptir. Trofektoderm doku biyopsisi ile alınan ortalama 4–5 hücrenin analizi sonuç verme oranının yükselmesini sağlar ve tekniksel sorunları da minimuma indirmiş olur. Bu sayede embriyoda hem anneden hem de babadan gelebilecek genetik bilgiler embriyodan kritik hücreler alınmadan incelenmektedir. Embriyolar blastosist aşamasına kadar kültüre edildiklerinde kromozomal anomaliye sahip embriyolar elenir ve başlangıçtaki embriyoların ancak sınırlı bir bölümü blastosist aşamasına ulaşabilir. Ancak, gelişim sırasında elenen ve blastosiste ulaşamayan embriyoların hem yüksek oranda genetik bozukluk taşıdığı hem de tutunma potansiyellerinin düşük olduğu göz önüne alındığında bu doğal seçilim bir avantaj olarak değerlendirilmelidir. Yüksek implantasyon (ana rahmine tutunma) potansiyeli olan daha az sayıdaki embriyoların transferiyle çoğul gebeliklerin de engellenmesi sağlanmış olur.

Tek gen hastalıkları ve HLA doku tipleme

Çocuklarına kendi taşıdıkları genetik bir hastalığı aktarma riski yüksek olan çiftlerde gebeliğin sağlıklı olup olmadığı prenatal (doğum öncesi) tanı yöntemleriyle anlaşılabilir. Fakat ne yazık ki, birçok çift, sağlıklı çocuk sahibi olana dek sayısız kere gebelik sonlandırılmasının psikolojik, fiziksel ve maddi yükünü taşımak zorunda kalmaktadır. Tek gen hastalıkları için PGT, hastalık taşıyan çiftlerde embriyoları önceden seçip normal veya sağlıklı olanlarının transfer edilmesi işlemine dayanmakta ve böylece çiftlerin sağlıklı çocuk sahibi olmalarını ve gebelik sonlandırması gibi istenmeyen ve komplikasyonlara yol açabilen bir gerekliliği ortadan kaldırmayı amaçlamaktadır. Bu amaçla merkezimize başvuran tek gen hastalığı taşıyıcısı olan çiftler, tüp bebek tedavisi programına alınmaktadır. IVF (In Vitro Fertilizasyon) denilen bu işlemde, anneden alınan yumurta hücreleri ile babadan alınan sperm hücreleri laboratuvar ortamında döllenmektedir. Döllenmeyi takiben normal gelişim gösteren embriyolar polar hücre, blastomer hücresi veya trofektoderm dokusu biyopsi yapılarak alınmakta ve tek hücre PCR metoduyla hastalığı taşıyan genetik bölge çoğaltılmaktadır.

İstanbul Memorial Hastanesi Genetik Tanı Merkezinde mutasyonu belirlenen her genetik hastalık için Preimplantasyon Genetik Tanı uygulaması yapılabilmektedir.

Beta talasemi, orak hücre anemisi ve Fankoni Anemisi gibi birçok ağır kan hastalıklarının tek tedavi yolu Allojenik Kök Hücre transplantasyonudur. En iyi tedavi sonucu ise tamamen HLA uyumlu kardeş donörden yapılan transplantasyon neticesinde alınabilmektedir. Transplantasyon HLA uyumlu kardeşten yapılmadığı taktirde yüksek morbidite oluşmakta ve hayatta kalma şansı düşmektedir.

HLA uyumlu kardeşin göbek kordonundan alınan kanın mükemmel bir kök hücre kaynağı olduğu bildirilmiştir. Bundan dolayı, genetik olarak kan hastalığı taşıyıcısı olan ve hastalıklı çocuk dünyaya getirmiş olan ailelerin, hem sağlıklı olan hem de hasta kardeşinin tedavisine imkan sağlayabilecek yeni bir çocuk sahibi olabilmeleri amacıyla Preimplantasyon HLA Tiplemesine olan talepleri giderek artmaktadır. İstanbul Memorial Hastanesi Tüp Bebek ve Genetik Tanı Merkezi, dünyada Preimplantasyon HLA Tiplemesini gerçekleştiren ilk ve az sayıdaki merkezlerden biridir.

Tek gen hastalıkları

Tek gen hastalıkları, tek bir gende meydana gelen mutasyon veya malformasyon sonucu oluşan hastalıklardır. Bugüne kadar yaklaşık 4000’e yakın tek gen hastalığı tanımlanmıştır. Otozomal dominant, otozomal resesif, X kromozomuna bağlı dominant ve resesif (Şekil 3), Y kromozomuna bağlı ve mitokondrial kalıtımla geçiş gösterebilirler.

Şekil 3: Otozomal resesif hastalıklar için uygulanan PGT çalışmalarında oluşturulan embriyoların %25’inin normal, %50’sinin taşıyıcı, %25’inin ise hasta olması beklenir (A). Otozomal dominant hastalıklarda ise çoğunlukla çiftlerden biri hastalıktan etkilenmiştir, çocuğuna bu hastalığı ge çirmesi ihtimali %50’dir (B).

Ülkemizde akraba evliliklerinin sık olması nedeniyle özellikle Akdeniz anemisi olarak bilinen beta-talasemi gibi otozomal resesif geçiş gösteren türde hastalıkların daha embriyo aşamasında (preimplantasyon tanı) tanılarının yapılması büyük önem arzetmektedir. Bu yöntem, ilgili kromozom bölgesinin tanımlandığı her tek gen hastalığı için uygulanabilir. Bunlara postnatal (doğum sonrası) ve/veya prenatal (doğum öncesi) tanı ile analiz edilebilen tek gen hastalıklarının tümü dahildir.

2000 yılından günümüze kadar merkezimizde çalışılmış hastalıkların sayısı (Tablo 1)  giderek artmış ve artmaya devam etmektedir.

PGT ile hangi tek gen hastalıklarına tanı koyulabilmektedir?

İstanbul Memorial Hastanesi Genetik Tanı Merkezinde mutasyonu belirlenen her genetik hastalık için Preimplantasyon Genetik Tanı uygulaması yapılabilmektedir. Bugüne kadar Memorial Hastanesi Tüp bebek merkezinde 196 ailede 277 PGT siklusunda 71 farklı tek gen hastalığı için PGT uygulanmıştır. Aşağıda PGT uygulanan tek gen hastalıklarının tam listesini görebilirsiniz. Bununla beraber 242 ailenin 461 siklusunda HLA tiplemesi yapılmıştır.

Tablo 1: Merkezimizde bu güne kadar PGT uygulanan hastalıkların listesi

Adrenolökodistrofi Ailesel Akdeniz ateşi Ailesel Hemofagositik lenfohistiyositozis (HLH) Ailesel Hipomagnezemi (Hiperkalsiüri ve Nefrokalsinoz ile Birlikte) Akçaağaç şurubu idrar hastalığı ARC sendromu (Arthrogryposis-Renal                   dysfunction-Cholestasis) Bartter sendromu Becker musküler distrofi (BMD) Beta talasemi Cam Kemik hastalığı (Osteogenesis Imperfecta) Charcot Marie tooth (CMT) sendromu Delta-Beta talasemi Donohue sendromu (Leprechaunizm) Duchenne kas distrofisi Ehler-Danlos Sendromu (EDS) Tip  VIIC Epidermolizis bullosa Facioscapulohumeral kas distrofisi (FSHD) Fankoni anemisi Fenilketonüri Frajil X sendromu Fraser Sendromu Galaktozemi Glikoz 6 fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği  Herediter multiple ekzositoz Hiper IgM Sendromu Hipohidrotik Ektodermal Displazi Hipomyelinizasyon ve konjenital katarakt Hunter Sendromu Huntington hastalığı İnfantil Nöroaksonal Distrofi Joubert Sendromu Keratit- iktiyoz-sağırlık (KID) sendromu Kistik Fibrozis Koenzim Q eksikliği Konjenital adrenal hiperplazi		Konjenital faktör 7 eksikliği Konjenital sağırlık Krabbe hastalığı Lafora hastalığı Leber'in konjenital amorozu Li-fraumeni sendromu Limb Girdle Musküler Distrofi (LMD) Meme kanseri Metakromatik lökodistrofi Miyotonik distrofi MTHFR eksikliği Mukolipidosis Mukopolisakkaridosis Tip 1 (Hurler Sendromu) Mukopolisakkaridosis Tip 3A (Sanfilippo sendromu) Mukopolisakkaridosis Tip 3B (Sanfilippo sendromu) Mukopolisakkaridosis Tip 6 Neimann-Pick hastalığı Nemalin miyopati Non-Ketotik Hiperglisinemi Nörofibromatozis Orak hücre anemisi Osteopetrosis (mermer kemik hastalığı) Polikistik böbrek hastalığı Pompe hastalığı Propiyonik asidemi Retinoblastoma Sitrullinemi Spastik parapleji Tip 3 Spastik parapleji Tip 5 Spinal müsküler atrofi (SMA) Spinoserebellar Ataksi Tip 2 (SCA2) Tay-Sachs hastalığı Tüberoz skleroz Tümör Nekrozis Faktör Reseptör İlişkili Periyodik Sendrom (TRAPS) Usher sendromu Tip 3B Zellweger sendromu

Listede adı geçen hastalıklardan talasemi, kistik fibroz, alfa mannosidozis, gibi hastalıklar Türkiye’de ilk defa, Bartter Sendromu ise dünyada ilk defa Memorial Hastanesi Tüp Bebek ve Genetik ekibi tarafından çalışılmıştır. Dünyada bugüne kadar çoğunlukla kistik fibroz, talasemi, orak hücre anemisi gibi konjenital hastalıklarda uygulanmış olan PGT yöntemi, Huntington ve Alzheimer Hastalığı gibi “late onset” (geç başlangıçlı) hastalıklarda ve tümör süpresör genlerdeki mutasyonlarla ortaya çıkan nörofibromatoz, retinoblastoma ve Li Fraumeni gibi kansere yakalanma riskini oldukça yükselten kalıtımsal predispozisyon hastalıklarında da uygulanmaktadır.

Mini sözlük

Gen: Hücrelerdeki DNA molekülü üzerindeki genetik özelliklerin nesiller boyu aktarılmasını sağlayan düzenleyici ve fonksiyonel özellikleri barındıran en küçük ünite. Alel: Genlerin farklı formlarından her birine alel denir. Anne ve babadan aktarılan iki ayrı alel geni oluşturarak genotipi belirler, eğer birbiri ile aynı ise kişi bu alel için homozigot, farklı ise heterozigottur. Otozomal resesif: Kalıtım şekli çekiniktir. Hastalığın oluşması için geni oluşturan allelerden her ikisinin de mutant olması gerekir. Genellikle ebeveynler taşıyıcı olup, çocuklarında bu hastalığın görülme ihtimali %25’tir (Şekil 3A). Akdeniz anemisi, orak hücre anemisi, spinal müsküler distrofi ve kistik fibroz bu hastalıklar arasında sayılabilir. Otozomal dominant: Kalıtım şekli baskındır. Bu hastalıklarda geni oluşturan allelerden yalnız birinin mutant olması hastalığın oluşması için yeterlidir. Bu gibi hastalıklarda ebeveynlerden biri hastalıktan etkilenmiştir. Çocuklarda görülme ihtimali %50’dir (Şekil 3B). Huntington, miyotonik distrofi bu hastalıklar arasında sayılabilir. Kompleks multifaktöriyel ve çok genli hastalıklar: Birçok genin hastalığın oluşumunu etkilediği, yaşam stili ve çevresel faktörlerin de etkisinin bulunduğu hastalıklardır. Astım, otoimmün hastalıklar, kanser, hipertansiyon ve diyabet bunlar arasında sayılabilir. HLA (Human Leukocyte Antigen, insan lökosit antijenleri): İnsanda bağışıklık sistemi ile ilgili birçok gen 6 nolu kromozomun p kolundaki bir bölgede kodlanır. Donor ve alıcıların HLA uyumu doku ve organ transplantasyonlarında hayati öneme sahiptir. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu, PZR): Isıya dayanıklı bakterilerden elde edilen özel bir polimeraz enzimi kullanılarak DNA molekülünü logaritmik olarak çoğaltmaya yarayan hassas bir yöntemdir. Her bir PZR döngüsü önce yüksek ısıda DNA molekülü zincirlerinin birbirinden ayrılması (denatürasyon), primerlerin eşlenen bölgelere bağlanması (annealing) , polimeraz enziminin baz dizileri ekleyerek ilgili bölgeyi sentezlemesi (synthesis) ve sentezlenen molekülün uzaması (extension) aşamalarından oluşur. Sentezlenmiş olan DNA fragmanı bir sonraki döngüde reaksiyon ortamında bulunan bir kalıp olarak kullanılır ve böylece her döngüde çoğaltılmış molekül sayısı ikiye katlanır. 30 ya da 40 döngü sonrasında milyonlarca DNA molekülü elde edilebilir.

Tek hücre PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) Yöntemi

Biyopsi yapılarak alınan blastomer hücreleri, içerisinde lysis (eritme) solüsyonu bulunan PCR tüplerine aktarılmaktadır. Bu yolla serbest kalan saf DNA molekülü, hastalığın bulunduğu genetik bölgeyi milyonlarca kopya halinde çoğaltamaya yarayan özel dizayn edilmiş primerler kullanılarak Tek Hücre PCR’ı dediğimiz bir dizi enzimatik reaksiyon uygulanmakta ve bu işlemi takiben mutasyon analiziyle sağlıklı veya hastalıklı embriyolar ayırt edilebilmektedir.

Kullanılan yöntem tek bir zincirden oluşan genetik materyalden milyonlarca kopya çıkaracak kadar hassas dizayn edildiği için, dışarıdan gelebilecek her türlü kontaminasyona karşı titizlikle çalışılmalıdır. Labaratuvarımız, Avrupa İnsan Üreme ve Embriyoloji Derneği (ESHRE) ve Preimplantasyon Genetik Tanı Uluslarası Topluluğu (PGDIS)’nun kalite standartlarını takip etmektedir.

HLA Doku Tayini

Tek gen hastalıkları için yapılan PGT işlemi bir tanı yöntemi olmasının yanı sıra, HLA uyumlu embriyo seçimi ile beraber yapıldığında bir tedavi yöntemi olarak karşımıza çıkmaktadır. İlk HLA tiplemesi çalışması Fanconi anemisi için yapılan bir PGT çalışmasıyla kombine edilmiş (Verlinsky ve arkadaşları, 2001) ve bu çalışma ile elde edilen gebeliğin sonrasında göbek kordonundan alınan kök hücrelerin nakliyle hasta kardeşte başarılı bir şekilde tedavi sağlanmıştır. Etyolojisinde bir mutasyonun olmadığı, tedavi için HLA uyumlu kök hücre naklinin gerektiği lösemi ve aplastik anemi gibi bir takım hastalıklar için ise sadece HLA tiplemesi yapılır.

HLA uyumlu bir embriyo bulunma şansının oldukça düşük olması (%25) ve mutasyon analizi de yapılacaksa bu ihtimalinin % 18’e kadar düşmesi tedavideki başarıyı sınırlayan en büyük etmendir. Bu nedenle iyi kalitede ve yeterli sayıda biyopsi uygulanabilir embriyo eldesi için çok iyi dizayn edilmiş stimülasyon protokollerinin uygulanması gerekir.

Embriyo transferi için uygun embriyo bulabilme ihtimalinin düşüklüğüne rağmen elde edilen veriler PGT-HLA işleminin uygulanabilirliğini ve faydasını kanıtlamaktadır. HLA tiplemesi için başvuran hastalar, transfer edilebilecek sağlıklı ve HLA uyumlu bir embriyo bulunduğunda oldukça yüksek gebelik oranları elde etmişlerdir.Kahraman ve ekibinin bu güne kadar yaptıkları çalışmalar sonucunda dünyaya gelen sağlıklı ve HLA uyumlu bebekler hasta kardeşleri için bir yaşam umudu oluşturmuş, elde edilen kordon kanı veya kemik iliği kök hücreleriyle hasta kardeşlerde tedavi sağlanmıştır. Bunlar içerisinde Akdeniz Anemisi gibi sık görülen olgular olduğu gibi Wiscott Aldrich Sendromu, Konjenital hipoplastik anemi mukopolisakkaridozis gibi nadir görülen hastalıklarda da başarı sağlanmıştır.

Tablo 2: Merkezimizde embriyolarda HLA tiplemesi uygulanan hastalıkların listesi

Hastalık Adı

Beta Talasemi

ALL (Akut Lenfoid Lösemi)

AML (Akut Myeloid Lösemi)

Diamond Blackfan Anemia

Alpha Mannosidozis

Gaucher Hastalığı

Wiskott-Aldrich Sendromu

Fanconi Anemisi

Hurler Sendromu

Histiocytosis

X-ALD (Adrenolökodistrofi)

Burkitt Lenfoma

KML (Kronik Myeloid Lösemi)

MDS (Myelodisplastik sendrom)

Aplastik Lenfoma

Glanzman Hastalığı

Anaplastik Büyük Hücreli Lenfoma

Hiper IgM Sendromu

Orak Hücre Anemisi

Trombositopeni

Hiper IgD

HLA Ön Hazırlık Çalışması, Sağlıklı ve HLA Doku Uyumlu Embriyoların Seçilerek Anneye Transfer Edilmesi

Embriyolarda genetik çalışmaya geçilmeden önce ailedeki mutasyonların ve HLA haplotiplerinin tespit edilmesi gerekmektedir. Aileler bu amaçla merkezimize başvurduklarında anne, baba ve hasta çocuktan kan alınmakta ve alınan bu kandan da her bir bireye ait DNA izole edilmektedir. İzole edilen DNA, ailedeki hastalığa sebep olan mutasyonun ve anne, baba ve hasta çocuğa ait HLA haplotiplerinin tespit edilmesinde kullanılmaktadır. Aile bireylerinin HLA haplotipleri HLA gen kompleksi üzerindeki STR markerları (DNA molekülü üzerindeki tekrar bölgeleri) kullanılarak yapılmaktadır. Bunun için yaklaşık 30 ayrı HLA STR markerı taranmakta ve bunlar arasından da en informatif (bilgi verici) en az 12 STR marker seçilerek embriyolardaki genetik çalışmada kullanılmaktadır(Şekil 4).

Şekil 4: Embriyolarda moleküler genetik analiz şeması

Kısırlık Tedavisine Yardımcı PGT Uygulamaları

Sayısal ve Yapısal Kromozom Bozuklukları

FISH tekniği

Anöplodi (sayısal kromozom bozuklukları) ve translokasyonların (yapısal kromozom bozuklukları) tayini için çoğunlukla FISH tekniği kullanılır. Bu teknik, biyopsi uygulanan hücrelerin cam lama fiksasyonu ile hücre çekirdeğinin eldesi, floresan işaretli prob uygulaması sonrası denatürasyon, hibridizasyon, hibridizasyon sonrası bağlanmayan probların uzaklaştırılması için yıkama, kontrast madde (counterstain) uygulaması ve analiz aşamalarından oluşur. Merkezimizde 8,13,14,15,16,17,19,18,20,21,22, X ve Y kromozomlarından oluşan ve spontan düşüklerde en sık rastlanan komozomal anomalilerin tespitine dayanan paneller kullanılmakta, bu panel ile de embriyolarda oluşabilecek, kromozomal anomalilerin büyük bir bölümü saptanabilmektedir.

Sınırlı sayıda kromozomun incelendiği FISH yöntemine alternatif olarak karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH, comparative genomic hybridization) yöntemi embriyolarda tüm kromozomların incelenmesini mümkün kılar. Ancak, tekniğin önemli bir dezavantajı vardır o da işlemin uzun sürmesi (yaklaşık 4-5 gün) sebebiyle embriyonun dondurulması zorunluluğunu getirmesidir. Eğer taze embriyo transferi yapılacaksa yalnızca maternal katkıları saptayabilen polar hücre biyopsisi sonrası yapılacak CGH uygulamaları tercih edilebilir.

Son yıllarda CGH ile aynı prensibe dayanan fakat array tabanlı bir sistem olan array-CGH yönteminin geliştirilmesi ile işlem süresi 48 saate kadar indirilmiş ve bir önceki yönteme göre çözünürlük de yükseltilmiştir. Tekniğin oldukça pahalı bir yöntem olması, optimizasyonunun zaman alması, sonuçların yorumlanması, analizdeki zorluklar, özel eğitimli personel ve uygun laboratuar altyapısı gerektirmesinden dolayı rutin kullanımı ile ilgili tecrübeler çok sınırlı kalmıştır. Bu nedenle FISH tekniği ile sayısal ve yapısal anomalilerin tespiti, halen en yaygın, ekonomik ve pratik bir yöntem olma avantajını korumaktadır.

Anöploidi taraması

PGT yöntemi günümüze kadar çoğunlukla gebelik kaybı ve kısırlığa sebep olan kromozomal bozuklukların ortaya konulması ve tüp bebek tedavisindeki başarı şansının arttırılması amacıyla kullanılmıştır. Embriyolarda anöploidi taraması, özellikle anne adayının yaşının ileri olduğu durumlar, tekrarlayan başarısız tüp bebek denemeleri, tekrarlayan düşükler ve şiddetli erkek faktörü gibi endikasyonları olan çiftlerde tedavideki başarıyı arttırmak ve gebelik kayıplarını azaltmak amacıyla kullanılan bir yöntemdir.

Tüm diploid insan hücreleri 22 otozom ve bir gonozomdan oluşan 23 çift kromozom içerir. Bu kromozom kuruluşundaki sayısal bozukluğa anöploidi, fazla (örneğin trizomi) veya eksik (monozomi) sayıda kromozom içeren hücreye anöploid hücre adı verilir.

Normal		Monozomi 21, Trizomi 22		Kompleks Anöploid
Şekil 5: Normal (A) ve Anormal (B, C) blastomer FISH görüntüleri: Analiz edilen kromozomlar; 13 (kırmızı), 16 (açık mavi), 18 (mavi), 21 (yeşil), 22 (sarı). “Normal” (A), “Monozomi 21, Trizomi 22” (B), ve “kompleks anöploid” (C) olarak değerlendirilen FISH görüntüleri. (Görüntüler İstanbul Memorial Hastanesi, Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarı’nda alınmıştır).

Hormonal, rahimsel ve immünolojik faktörler ekarte edildikten sonra iyi kalitede embriyo transferine rağmen 3 veya daha fazla denemede tekrarlayan implantasyon başarısızlıkları (TİB) olan çiftlerde yapılan PGT çalışmalarında embriyolarda oldukça yüksek oranda kromozomal bozukluk tespit edilmiştir. Bu bozuklukların önemli bir kısmını kompleks yani 3 veya daha fazla kromozomu içeren sayısal anomaliler oluşturmaktadır (Şekil 5C).

Merkezimizde 2000 yılından itibaren uygulanan PGT işlemi sayesinde aynı endikasyonu taşıyan ve PGT uygulanmayan hasta gruplarına göre daha yüksek oranında gebelik elde edilmiştir.

Translokasyon Taşıyıcılığı

Kromozomal translokasyonların yenidoğanlarda görülme sıklığı % 0,2 iken, bu oran tekrarlayan başarısız denemeleri olan çiftlerde % 2,5’a, tekrarlayan düşükleri olan çiftlerde ise % 9,2’ye kadar yükselmektedir.

Robertsonian translokasyonlar iki akrosentrik kromozomun (13,14,15,21,22) p kollarının birleşmesiyle oluşur (Şekil 6A). Dengeli resiprokal translokasyonlar ise homolog olmayan iki kromozom arasında parça kaybı olmaksızın kromozomların çoğunlukla uç bölgelerinin yer değiştirmesi şeklinde meydana gelir (şekil 6B).

Şekil 6: Robertsonian translokasyon taşıyıcısına ait bir karyotip görüntüsü: 45XY,der (13;14)(q10;q10) (A). Resiprokal translokasyon taşıyıcısına ait karyotip görüntüsü: 46,XY, t(7;13)(q22;q12) (B) (Görüntüler İstanbul Memorial Hastanesi, Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarında alınmıştır).

Şekil 7: PGT işlemi öncesi set up çalışmasına bir örnek. 1 ve 16 nolu kromozomlar arasında meydana gelen 46,XY,t(1;16)(q10;q10) translokasyonunda FISH ile kırık bölgelerinin doğrulanması. Kullanılan problar: CEP 1 (spectrum orange), CEP 16 (spectrum aqua), Tel 16p (spectrum green), Tel 16q (spectrum orange) (Vysis, Abbott) (A). Robertsonian 13;14 translokasyonu taşıyıcısına, ait spermlerde LSI 13 nolu kromozom (yeşil) ve Tel 14 nolu kromozom (kırmızı) problarıyla yapılan FISH çalışması görüntüsü: 45,XY,der(13;14)(q10;q10). Üstte normal veya dengeli bir sperm, altta ise dengesiz (nullizomi 14) sperm görülmektedir (B)(Görüntüler İstanbul Memorial Hastanesi, Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarında alınmıştır).

Translokasyon Taşıyıcılığında PGT Öncesi Ön Hazırlık Çalışmasının Önemi

Translokasyon taşıyıcıları için yapılacak PGT çalışmalarından önce bir hazırlık aşamasının (set-up, ön hazırlık) tamamlanması gerekir. Bu aşamada, sitogenetik analizle translokasyon taşıyıcılığı saptanmış çiftlerde, FISH analiziyle kırık noktalarının doğrulanması, PGT çalışmasında kullanılacak probları belirlemek açısından çok önemlidir (Şekil 7A). Bunun için eşlerden kan alınıp kromozmların incelenmesi ve FISH yöntemiyle kromozomlar üğzerindeki kırık noktalarının teyidinin yapılması gerekmektedir. Yine PGT işlemi öncesinde eğer çiftlerde baba adayı translokasyon taşıyıcısı ise, spermde yapılacak FISH analiziyle sperm hücrelerindeki normal veya dengeli/dengesiz gamet oranını saptamak mümkün olabilmektedir. Sperm FISH, özellikle resiprokal translokasyon taşıyıcılarının embriyolarında dengeli/dengesiz embriyo oranının tahmin edilmesinde ve tedavide yol gösterici olması bakımından oldukça faydalıdır (Şekil 7B).

Normal veya dengeli bir embriyonun bulunma şansının azlığına rağmen transfer ile sonuçlanan tedavilerde elde edilen gebelik oranları oldukça yüksektir. PGT, bu hasta grubunda gebelik oranını arttırmakta ve gebelik kayıplarını azaltmaktadır.

İstanbul Memorial Hastanesi Tüp Bebek ve Genetik Merkezinde Robertsonian veya Resiprokal translokasyon taşıyıcılığı nedeniyle PGT uygulanan olguların embriyolarında yüksek oranda anormallik tespit edilmiştir. Anormal embriyoların PGT yöntemi ile elenmesi ve normal veya dengeli olan embriyoların transferi ile oldukça yüksek gebelik oranları elde edilmiş ve bu hastaların tekralayan gebelik kayıpları yaşaması engellenmiştir.

Mikroarray Yöntemi

Array-Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (a-CGH), DNA miktarındaki değişiklikleri saptayan en yeni moleküler yöntemdir. Bu teknik ile embriyolardaki kromozomların tümü incelenebilir. Bu yöntem sayısal incelemenin yanı sıra kromozomların yapısal olarak da incelenmesini mümkün kılar. Böylece kromozomlar üzerindeki delesyon veya duplikasyonlar, translokasyon taşıyıcılığı nedeniyle kromozomların kollarında oluşan anormallikler saptanabilmektedir. İşlem süresinin kısa olması ve analiz sürecinin bilgisayar programları sayesinde daha otomatik bir şekilde yapılması sonucu kromozomlarla ilgili veriler 12-24 saat gibi kısa sürelerde elde edilebilmektedir. Bu sayede sonuçlar embriyoların dondurulmasına gerek kalmadan transfer gününden önce elde edilmektedir. a-CGH yöntemi doğru embriyo seçimi için en güvenilir yöntemdir bu sebeple İstanbul Memorial Hastanesi Tüp Bebek ve Genetik Laboratuvarı’nda a-CGH yöntemi kullanılmaktadır.(daha deteylı bilgi için tıklayınız)