Gebelik kayıplarına ve anormal doğumlara sebep olabilen kromozomal anormalliklerin babadan kaynaklan önemli bir bölümü sperm yapım aşamasındayken de novo yani yeni oluşum olarak gerçekleşir.

 

Moleküler sitogenetik inceleme için, kromozomlar çeşitli floresan boyalarla işaretlenip analiz için hazırlanır. Bu yönteme FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) adı verilir. Kromozomlar amaca göre farklı bölgelerinden işaretlenip analiz edilebilirler. FISH yönteminin avantajı kromozomlar elde edilmeden direk hücre çekirdeğine uygulanabilmesidir. Prenatal tanı ve preimplantasyon genetik tanıda paneller halinde uygulandığında bir seferde 5, iki seferde toplam 9 kromozoma kadar (13, 16, 18, 21, 22 ve 15, 17, X, Y) incelenebilir.

  • FISH Analizi yapılabilen örnekler
    • Periferik Kan
    • Fetal Kan (Bebek kordon kanı)
    • Amniyon
    • CVS (Koryon Villus Biyopsi)
    • Tahliye Materyali (Düşük Materyali)
    • Doku, cilt biyopsisi
    • Sperm
    • Blastomer (Embriyo hücresi)
  • FISH uygulamaları
    • Mikrodelesyon sendromları için hücre kültüründen spesifik problarla FISH analizi (kan, cilt dokusu)
      • Prader-Willi/Angelman Sendromu
      • DiGeorge Sendromu
      • Williams Sendromu
      • Retinoblastoma
      • BCR/ABL
    • Amnion sıvısından spesifik problarla FISH analizi
    • Amnion sıvısından FISH ile hızlı anöploidi incelemesi (13, 18, 21, X ve Y)
    • Marker kromozomlar için FISH analizi
    • Blastomerlerde anöploidi testi ve translokasyonlar için spesifik problarla FISH analizi (Preimplantasyon genetik tanı)
    • Sperm FISH analizi


Spesifik problarla FISH analizi


XXY (Klinefelter Sendromu)

 

Sperm FISH

Gebelik kayıplarına ve anormal doğumlara sebep olabilen kromozomal anormalliklerin babadan kaynaklan önemli bir bölümü sperm yapım aşamasındayken de novo yani yeni oluşum olarak gerçekleşir. Anormal durumlarda, sperm bir veya daha fazla kromozomu fazladan yada eksik taşıyor olabilir (anöploid), yada fazladan bir kromozom seti taşıyor olabilir (diploid). Bu gibi durumları belirleyebilmek için sperme FISH işlemi (Floresan boyalarla inceleme) uygulanır. Bu işlemde 13, 18, 21, X ve Y kromozomları incelenir. Eğer baba adayı translokasyon (kromozomlar arası yeniden düzenlenmeler) taşıyıcısı ise bu translokasyona katılan kromozomlara yönelik özel FISH işlemi de uygulanabilir. Bu yöntemle, kişinin dengesiz gamet yüzdesi hesaplanabilir ve oluşacak embriyolarındaki dengeli-dengesiz oranı hakkında fikir sahibi olunabilir. 1000 adet sperm incelenerek anormal sperm yüzdesi belirlenir.


Anormal Sperm

 

PREİMPLANTASYON GENETİK TANIDA (PGT) YENİ YÖNTEMLER – CGH VE MICROARRAYLER

Tüp bebek yönteminde embriyoların yaşam kalitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisi embriyonun kromozom içeriğidir. Gebeliğin erken döneminde oluşan düşüklerin %50-60'ından kromozom bozuklukları sorumludur. Embriyonun gelişimi ve morfolojisi ne yazık ki embriyonun kromozomları hakkında bilgi verememektedir. Bununla birlikte tüp bebek yöntemindeki yeni gelişmeler sayesinde, embriyolar gebelik elde edilmeden önce kromozom bozuklukları açısından incelenebilmektedir. Kromozom bozukluklarının gebelik oluşmadan önce test edilerek sağlıklı embriyoların transfer edilmesi işlemine “implantasyon öncesi genetik tanı” veya “preimplantasyon genetik tanı (PGT)” adı verilir. PGT’nin günlük kullanımı ile ailenin taşıyıcı olduğu kromozomal anormallikleri embriyo aşamasında belirlenebilmekte ve sağlıklı çocukların doğması sağlanabilmektedir. Ek olarak daha çok ileri anne yaşı kaynaklı kromozom anomalilerinin, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı, anomalili fetüs öyküsü olan ailelerde de sağlıklı ve başarılı gebelikler sağlanabilmektedir.

PGT işlemi günümüzde yaygın olarak FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) yöntemiyle yapılmaktadır. FISH yönteminde kromozomlara özel olarak hazırlanmış olan ve ‘flöresan problar’ diye adlandırılan doğal renklerdeki belirleyici sistemler kullanılmaktadır. Yapılan biyopsi sonucu embriyodan alınan hücrelerin kromozomlarına bu flöresan probların bağlanmasından sonra bu hücrelerden alınan sinyaller mikroskop aracılığıyla incelenip kromozom sayıları hakkında bilgi edinilmektedir. FISH yönteminde kullanılabilen ayrı renklerdeki probların fazla sayıda olmaması ve her bir veya bir kaç işaretlemenin belirli bir süre alması nedeniyle bu yöntemle incelenebilen kromozom sayısı sınırlı olmaktadır. Ayrıca FISH yönteminde kromozomlara ait sinyallerinin üst üste gelmesi bu yöntemin diğer bir dezavantajıdır.

Embriyolarda tüm kromozomların incelenebilmesi için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. İlk defa 1996 yılında blastomerlerde uygulanan Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Comparative Genomic Hybridization - CGH) yöntemi, hücrenin bütün kromozomlarının incelenebilmesini sağlamaktadır. Çalışma prensibi Şekil 1’de detaylandırılan CGH yöntemi, FISH yöntemiyle karşılaştırıldığı zaman birçok avantaja sahiptir. Bütün kromozom sayılarının incelenebilmesine ek olarak, bir kromozom için birçok belirleyicinin kullanılması FISH yöntemiyle belirlenemeyecek kadar küçük ancak önemli olabilecek birçok bozukluğun (kromozom üzerindeki küçük kayıplar; delesyon veya artışlar; duplikasyon gibi) belirlenebilmesine imkân tanımaktadır. Yapılan çalışmalar CGH yöntemiyle belirlenen kromozom bozukluklarının %20-40’nın FISH yöntemiyle belirlenemeyeceğini ortaya çıkarmıştır. Ayrıca teknik olarak uygulamanın kolay olması ve her evredeki hücrelere uygulanabilmesi yöntemin diğer avantajları arasındadır.

Şekil 1: Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Comparative Genomik Hibridization - CGH)

 

CGH yönteminin preimplantasyon genetik tanıda kullanılmasının önündeki en büyük engel, yöntemin süresinin uzun olmasından dolayı (4-5 gün) IVF işleminin süresine uymamasıdır. Ancak bu sorunda, yumurtaların ilk toplandıkları gün, kutup cisimciklerinin incelenmesi ile veya biyopsi yapılan embriyonun sonuçlar elde edilene kadar dondurulması ve sonrasında transfer edilmesi ile giderilebilmektedir.

 

PREİMPLANTASYON GENETİK TARAMADA MİKROARRAYLER:

Günümüzde bütün kromozomların taranması için en çok ümit vaat eden yöntem mikroarraylerin kullanımı olarak gözükmektedir. DNA microarrayleri cam, plastik veya silikon gibi katı bir yüzeye tutturularak sıralı bir şekilde oluşturulmuş mikroskobik DNA dizi noktacıklarıdır (Şekil 2). Bir mikroarrayde “prob” adı verilen bu noktacıklardan on binlerce bulunabilir. Bu sayede aynı anda kromozomlar üzerindeki birçok bölgenin incelenmesi mümkün olmaktadır.

Şekil 2: DNA mikroarray temel çalışma prensibi

Mikroarrayde kullanılan prob sayısı FISH ve CGH yönteminde kullanılabilen prob sayısına kıyasla daha fazla olduğu için mikroarrayler daha fazla bilgi verici olmaktadır. Ayrıca hibridizasyon süresinin daha kısa olması ve analiz sürecinin bilgisayar programları sayesinde daha otomatik bir şekilde yapılması sonucu kromozomlarla ilgili veriler 48 saatten daha kısa sürelerde elde edilebilmektedir. Bu sayede embriyolardan biyopsiyle alınan hücrelerin PGT sonuçlarının embriyoların dondurulmasına gerek kalmadan transfer gününden önce elde edilmesi mümkün olmaktadır. Mikroarray yönteminin kullanılmasıyla yapılan ilk klinik PGT çalışmasında 8 hastadan 6’sında gebelik elde edilmiştir.

CGH ve mikroarrayler şu an için PGT alanında aktif olarak kullanılan veya uygulanan teknikler olmamasına rağmen, bu teknikler üzerinde deneysel ve klinik araştırmalar devam etmektedir. Özellikle analiz işleminin karmaşık olması, maliyetin uygulanmakta olan FISH yöntemine kıyasla yüksek oluşu gibi problemler bulunmakla birlikte bu teknikler PGT için umut vaat etmektedir.